| 公開(公告)號 | CN1840708A |
| 公開(公告)日 | 2006.10.04 |
| 申請(專利)號 | CN200610013092.2 |
| 申請日期 | 2006.01.23 |
| 專利名稱 | 用于治療免疫耐受相關(guān)疾病的基因的篩選和鑒定方法 |
| 主分類號 | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分類號 | C12Q1/68(2006.01)I;C12Q1/04(2006.01)I;C12N5/08(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 南開大學 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 楊榮存;R.盧登;W.如適;張 園 |
| 地址 | 300071天津市衛(wèi)津路94號南開大學醫(yī)學院 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 天津市學苑有限責任專利代理事務(wù)所 |
| 代理人 | 趙尊生 |
| 國省代碼 | 天津;12 |
| 主權(quán)項 | 一種用于治療免疫耐受相關(guān)疾病的基因的篩選和鑒定方法，其特征在于包括下述步驟： (1)免疫耐受樹突細胞的制備和鑒定 1)從卵巢癌患者的全血用Ficoll分離出白細胞，用生理鹽水洗三次放入裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)1小時，保留粘附在培養(yǎng)瓶上的單核細胞，反復用生理鹽水沖洗去除非粘附的細胞，然后加入6ml含有1000U的人GM-CSF和1000UIL-4，繼續(xù)培養(yǎng)4天，得到的樹突細胞作為未成熟的樹突細胞；培養(yǎng)基含有10％小牛血清的PRMI1640培養(yǎng)基，同時加入1％的青和1％鏈霉素。 2)將培養(yǎng)4天的未成熟的樹突細胞，用生理鹽水洗三次，在24孔板分別與來自同一病人的卵巢癌腫瘤細胞、用Co60已照射卵巢癌細胞或卵巢癌細胞上清液共同培養(yǎng)9天；卵巢腫瘤細胞與樹突細胞的比例為1∶10(數(shù)量比)；所述的卵巢癌腫瘤細胞是從卵巢癌患者新鮮的腹水中分離的腫瘤細胞，采用磁力珠分離方法去除潛在污染的淋巴細胞。 3)使用流式細胞儀將培養(yǎng)9天后的樹突細胞與卵巢癌細胞分離，得到樹突細胞； 4)鑒定免疫耐受樹突細胞：免疫耐受樹突細胞用生理鹽水洗三次后，分別加PharminGen公司提供的2μlFITC螢光素標記的抗CD40、CD80和CD86抗體染色，用流式細胞儀分析，分析免疫耐受樹突細胞刺激分子的表達； 5)用同一病人外周血引導流感病毒多肽“Mp58-66peptide(GILGFVFTL，GIL；designatedasA2-GIL)”特異性的HLA-0201限制性T細胞系，分離的人T細胞與裝載流感病毒多肽的樹突細胞共同培養(yǎng)，每周刺激一次，共刺激三次。腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細胞與對照樹突細胞在裝載流感病毒多肽“Mp58-66peptide后作為刺激細胞，共同培養(yǎng)48小時，取上清液，通過酶聯(lián)試劑盒分析上清液中的IFN-γ(干擾素γ)含量。 6)分析免疫耐受樹突細胞引導CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞的能力，當腫瘤相關(guān)的免疫耐受樹突細胞或?qū)φ諛渫患毎c來自同一病人T細胞在一定比例(樹突細胞∶T細胞＝1∶10)共同培養(yǎng)9天，通過FITC標記的抗CD4抗體和PE標記的抗CD25抗體染色和流式細胞儀分析腫瘤相關(guān)的免疫耐受樹突細胞引導CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細胞產(chǎn)生。 7)分析免疫耐受樹突細胞產(chǎn)生細胞因子的能力。用半定量PCR測定免疫耐受樹突細胞IL-10和IL-12的轉(zhuǎn)錄水平，用Invitrogen公司提供的RT-PCR試劑盒測定IL-10和IL-12的轉(zhuǎn)錄水平，IL-10引物：5’atgcacagctcagcactgctctgttgc3’和3’gtttcgtatcttcattgtcatg5’；IL-12p40引物：5’atgtgtcaccagcagttggtcatctc3’3’actgcagggcacagatgcccattc5’。 (2)免疫耐受樹突細胞內(nèi)免疫耐受基因的篩選 1)首先按照Invitrogen公司提供的步驟，從腫瘤相關(guān)性樹突細胞用Trizol試劑提取總RNA； 2)對腫瘤相關(guān)性樹突細胞總RNA通過基因芯片進行分析，所用基因芯片是Affymetrixhumangenechipplatforms，由美國約翰霍普金斯大學醫(yī)學院(TheJohneHopkinsUniversitySchoolofMedicine)基因組研究室分析； (3)篩選和鑒定免疫耐受相關(guān)基因 1)、首先，用寡核苷酸和dT作為引物(Proligo，Boulder，co)以及SuperScriptchoice合成單股cDNA。 2)、然后合成雙股cDNA，雙股cDNA通過苯酚-氯仿抽提后(等體積，1∶1)，利用BioArrayRNAhighyieldTranscriptlabeling試劑盒(InzoBioche)，通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生Biomylatedanti-sensecRNA。 3)隨后處理過的cRNA與在45℃與Affymetrix基因組基因芯片雜交，用AffymetrixFluidicsStation400洗染芯片除去未雜交的cRNA，然后用streptavidin-PE結(jié)合BiotimylatedcRNA，再與羊抗-streptavidinAb孵育，用Hewlett-PackardG2500GeneArray檢測熒光強度，用MicroArraySuite5.0軟件(Affymetrix公司)對每個基因芯片進行圖像分析； 4)采用AgilentBioanalyzer(PaloAlto，CA)，“Labonachip”(芯片實驗室)技術(shù)證實所有樣本有著類似的rRNA比率； 5)根據(jù)美國NIH基因庫提供的生物信息，對在腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細胞基因芯片分析中明顯上調(diào)的基因或明顯下調(diào)的基因，結(jié)合基因庫提供生物信息進行分析。 |
| 摘要 | 本發(fā)明提供了用于治療免疫耐受相關(guān)疾病的基因的篩選和鑒定方法。通過體外培養(yǎng)建立了制備人免疫耐受樹突細胞的方法。對腫瘤相關(guān)免疫耐受樹突細胞遺傳背景分析，篩選和鑒定了樹突細胞內(nèi)與免疫耐受功能有關(guān)的基因：FLJ20151、FLJ23306、FLJ20151、FLJ21080、FLJ10055、FLJ20967、FLJ12287、FLJ11565、MGC45806或DKFZp434K1210。，這些基因參與免疫耐受的引導，在免疫相關(guān)性疾病如抗移植排斥反應(yīng)、腫瘤、炎癥、自身免疫性疾病有著潛在的應(yīng)用價值。 |
| 國際公布 |
