| 公開(kāi)(公告)號(hào) | CN1247615C |
| 公開(kāi)(公告)日 | 2006.03.29 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN03154208.5 |
| 申請(qǐng)日期 | 2000.03.21 |
| 專利名稱 | 人體心肌肌鈣蛋白Ⅰ的純化和其單克隆抗體的制備方法 |
| 主分類號(hào) | C07K14/435(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C07K14/435(2006.01)I;C07K16/18(2006.01)I;C12P21/08(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | 00112156.1 |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 上海潤(rùn)東生物科技有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 張寄南;蘇恩本 |
| 地址 | 200135上海市浦東桃林路18號(hào)環(huán)球廣場(chǎng)B2405室 |
| 頒證日 | |
| 國(guó)際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國(guó)家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 |
| 代理人 | 徐冬濤 |
| 國(guó)省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 人體心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體的制備方法，其特征在于包含如下步驟： (1)取人體新鮮或速凍冷藏的心肌組織，去脂肪及纖維，經(jīng)勻漿、離心、沉淀、抽提、高鹽溶解等步驟處理后，在層析介質(zhì)為CMSephadex-C50、Cellulose-DE52，緩沖體系為Tris-HCl，pH值為7.2～7.8，尿素含量為6～8mol/L條件下依次進(jìn)行層析，分別收集含心肌肌鈣蛋白C(cTnC)和心肌肌鈣蛋白I(cTnI)的蛋白峰； (2)取上述步驟(1)所得心肌肌鈣蛋白C，在偶聯(lián)溶液為0.1～0.3mol/LNaHCO3，pH值為7.8～8.5，3～6mmol/LCaCl2，平衡緩沖液為45～55mmol/LTris-HCl，8～10mol/L尿素，0.8～1.2mmol/LCaCl2，12～18mmol/Lβ巰基乙醇，pH值為7.8～8.2的條件下與Sepharose4B親和層析柱相偶聯(lián)，制備成Sepharose4B親和層析柱； (3)取上述步驟(1)經(jīng)CMSephadex-C50層析后的粗提品的心肌肌鈣蛋白I峰收集液，再加入步驟(2)所得Sepharose4B親和層析柱進(jìn)行親和層析，即得純化的心肌肌鈣蛋白I； (4)取上述步驟(3)所制得的心肌肌鈣蛋白I，多次注入BALB/c小鼠腹腔免疫小鼠，間隔時(shí)間為2～3周，至小鼠血清抗心肌肌鈣蛋白I抗體滴度大于1∶2000，取小鼠脾細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞； (5)將上述步驟(4)的二種細(xì)胞混勻，加入DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液處理，再加入含15～20％胎牛血清的HAT培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，進(jìn)行細(xì)胞融合； (6)取上述步驟(5)的培養(yǎng)液上清，用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中的雜交瘤細(xì)胞，即心肌肌鈣蛋白I的特異性抗體； (7)取上述步驟(6)檢測(cè)出的雜交瘤細(xì)胞采用有限稀釋法培養(yǎng)，制得增殖的同源性細(xì)胞克隆，即單克隆細(xì)胞株。 |
| 摘要 | 本發(fā)明公開(kāi)了人體心肌肌鈣蛋白I的純化和其單克隆抗體的制備方法以及一步法測(cè)定其含量的方法。其特點(diǎn)是采用親和層析法純化人體心肌肌鈣蛋白I，利用該純化的心肌肌鈣蛋白I與BALB/c小鼠免疫制備該心肌肌鈣蛋白I的單克隆抗體，并建立了一步法測(cè)定心肌肌鈣蛋白I含量的方法。其優(yōu)點(diǎn)是所得抗體的同源性好，特異性和敏感性高。其檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，成本低。可廣泛用于心臟病的檢查。 |
| 國(guó)際公布 |
