網(wǎng)站首頁(yè)
醫(yī)師
藥師
護(hù)士
衛(wèi)生資格
高級(jí)職稱
住院醫(yī)師
畜牧獸醫(yī)
醫(yī)學(xué)考研
醫(yī)學(xué)論文
醫(yī)學(xué)會(huì)議
考試寶典
網(wǎng)校
論壇
招聘
最新更新
網(wǎng)站地圖
您現(xiàn)在的位置: 醫(yī)學(xué)全在線 >> 藥學(xué)理論 >> 中國(guó)藥品專利文獻(xiàn) >> 正文:利用酵母生產(chǎn)非N-糖基化蛋白的方法專利檢索:專利號(hào)/專利人/發(fā)明人
    

利用酵母生產(chǎn)非N-糖基化蛋白的方法

公開(kāi)(公告)號(hào) CN1746302A  
公開(kāi)(公告)日 2006.03.15  
申請(qǐng)(專利)號(hào) CN200510044079.9  
申請(qǐng)日期 2005.07.18  
專利名稱 利用酵母生產(chǎn)非N-糖基化蛋白的方法  
主分類號(hào) C12N15/09(2006.01)I  
分類號(hào) C12N15/09(2006.01)I;C12N15/81(2006.01)I;C12N15/52(2006.01)I;C12P21/02(2006.01)I  
分案原申請(qǐng)?zhí)?  
優(yōu)先權(quán)  
申請(qǐng)(專利權(quán))人 山東大學(xué)  
發(fā)明(設(shè)計(jì))人 祁慶生;蘇移山;王 鵬  
地址 250100山東省濟(jì)南市山大南路27號(hào)  
頒證日  
國(guó)際申請(qǐng)  
進(jìn)入國(guó)家日期  
專利代理機(jī)構(gòu) 濟(jì)南圣達(dá)專利商標(biāo)事務(wù)所  
代理人 鄭華清  
國(guó)省代碼 山東;37  
主權(quán)項(xiàng) 一種利用酵母生產(chǎn)非N-糖基化蛋白的方法,由下述步驟組成 (1)重組表達(dá)載體的構(gòu)建: 克隆出N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidase(PNGase,EC3.5.1.52)基因,經(jīng)酶切后插入大腸桿菌載體,命名為vector-PNG;然后克隆出酵母性凝集因子C-末端錨定位點(diǎn)基因,經(jīng)酶切后插入到vector-PNG載體;與N-糖酰胺酶基因形成融合基因,載體命名為vector-PNG-A;vector-PNG-A載體經(jīng)EcoRI、NotI酶切后回收小片段,插入經(jīng)相同酶切的酵母表達(dá)載體,獲得了帶有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重組載體命名為pPIC9k--PNG-A; (2)重組酵母菌株的構(gòu)建: 用SalI將重組載體pPIC9k-PNG-A線性化;電轉(zhuǎn)到酵母菌株基因組中,構(gòu)建重組酵母菌株;在MD平板上長(zhǎng)出的菌落為陽(yáng)性克; 其中,MD平板培養(yǎng)基配方為:13.4g/L酵母基本氮源;0.4mg/L生物素;20g/L葡萄糖; (3)分泌糖蛋白的重組菌株的構(gòu)建: 將糖蛋白基因插入到pPIC9K載體的α-factor信號(hào)肽下游的多克隆位點(diǎn),獲得了含有糖蛋白基因分泌表達(dá)載體;用SacI將含有該糖蛋白基因的pPIC9K載體線性化,利用電轉(zhuǎn)化的方法將線性化的重組載體,轉(zhuǎn)化到上述構(gòu)建的表面表達(dá)N-糖酰胺酶的重組酵母菌株基因組中,構(gòu)建成分泌表達(dá)目的蛋白的酵母重組工程菌株;通過(guò)G418抗生素篩選出陽(yáng)性克隆菌株; (4)糖蛋白在酵母中誘導(dǎo)表達(dá): 將上述陽(yáng)性克隆工程菌株,接種于YPD培養(yǎng)基中,30℃培養(yǎng)12-24小時(shí),搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分;當(dāng)發(fā)酵液濃度達(dá)OD=5-6時(shí),按體積比1∶100的接種量轉(zhuǎn)接到BMG培養(yǎng)基中培養(yǎng),溫度30℃,搖床轉(zhuǎn)速為240-270轉(zhuǎn)/分,培養(yǎng)28~35小時(shí);5000g離心5~10分鐘,收集菌體,用PBS洗滌菌體1~2次,轉(zhuǎn)接到BMM液體培養(yǎng)基中,使發(fā)酵液濃度達(dá)OD=0.5-1.0時(shí),誘導(dǎo)培養(yǎng),誘導(dǎo)溫度20℃-30℃,搖床轉(zhuǎn)速為180-250轉(zhuǎn)/分,每隔12小時(shí)向培養(yǎng)基中加入5~10ml/L量的甲醇,誘導(dǎo)溫度20℃-30℃,搖床轉(zhuǎn)速為180-250轉(zhuǎn)/分,培養(yǎng)36-60小時(shí);將N-糖酰胺酶表達(dá)于酵母細(xì)胞壁表面,同時(shí)外源糖蛋白分泌表達(dá)到培養(yǎng)介質(zhì)中;在培養(yǎng)介質(zhì)中,表面表達(dá)的N-糖酰胺酶將分泌表達(dá)的糖蛋白的糖鏈切除,生成了非N-糖基化蛋白; 其中PBS為:pH6.0,100mM磷酸鹽緩沖液; 其中YPD培養(yǎng)基配方為:10g/L酵母粉;20g/L蛋白胨;20g/L葡萄糖; 其中BMG培養(yǎng)基配方為:pH6.0,100mM磷酸鹽緩沖液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甘油10mL/L; 其中BMM液體培養(yǎng)基配方為:pH6.0,100mM磷酸鹽緩沖液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甲醇5mL/L; 其中,上述重組陽(yáng)性克隆工程菌株可以通過(guò)離心、過(guò)濾去除。  
摘要 本發(fā)明公開(kāi)了一種利用酵母生產(chǎn)非N-糖基化蛋白的方法,即利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建含有N-糖酰胺酶和目的蛋白基因的表達(dá)載體,并通過(guò)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入酵母菌中,N-糖酰胺酶穩(wěn)定表達(dá)在酵母細(xì)胞表面,目的蛋白經(jīng)分泌表達(dá)到培養(yǎng)介質(zhì)中,在分泌和培養(yǎng)過(guò)程中,表面表達(dá)的N-糖酰胺酶將分泌表達(dá)的目的糖蛋白的糖鏈除去,從而獲得經(jīng)過(guò)真核表達(dá)系統(tǒng)分泌的非N-糖基化蛋白。利用本發(fā)明的方法獲得的蛋白經(jīng)過(guò)真核蛋白的后處理加工,具有正確的構(gòu)像和三級(jí)結(jié)構(gòu),但不具有酵母蛋白的N-糖基化,若作為蛋白藥物不會(huì)在人體內(nèi)產(chǎn)生免疫源性;也不會(huì)因?yàn)檫^(guò)糖基化使表達(dá)蛋白失去活性。  
國(guó)際公布  
...
評(píng)論加載中...
網(wǎng) 名: (必填項(xiàng))
評(píng)論內(nèi)容:
關(guān)于我們 - 聯(lián)系我們 -版權(quán)申明 -誠(chéng)聘英才 - 網(wǎng)站地圖 - 醫(yī)學(xué)論壇 - 醫(yī)學(xué)博客 - 網(wǎng)絡(luò)課程 - 幫助
醫(yī)學(xué)全在線 版權(quán)所有© CopyRight 2006-2046, MED126.COM, All Rights Reserved
浙ICP備12017320號(hào)-1
百度大聯(lián)盟認(rèn)證綠色會(huì)員可信網(wǎng)站 中網(wǎng)驗(yàn)證