| 公開(公告)號 | CN100335642C |
| 公開(公告)日 | 2007.09.05 |
| 申請(專利)號 | CN200510010697.1 |
| 申請日期 | 2005.03.16 |
| 專利名稱 | 基因重組畢赤酵母生產(chǎn)番茄紅素的方法 |
| 主分類號 | C12P5/02(2006.01)I |
| 分類號 | C12P5/02(2006.01)I;C12N1/16(2006.01)I;C12N15/63(2006.01)I |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 佛山市英邁瑞生物技術(shù)服務(wù)有限公司 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 李 明 |
| 地址 | 528212廣東省佛山市南海區(qū)西樵錦湖路西樵合城纖維廠側(cè) |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 廣州三環(huán)專利代理有限公司 |
| 代理人 | 詹仲國 |
| 國省代碼 | 廣東;44 |
| 主權(quán)項 | 一種基因重組畢赤酵母生產(chǎn)番茄紅素的方法，其特征在于，它是從細(xì)菌噬夏孢歐文氏菌(Erwiniauredovora)中克隆出合成番茄紅素的三個關(guān)鍵基因CrtE、CrtB、CrtI，在巴斯德畢赤氏酵母中重建合成番茄代謝流，使巴斯德畢赤氏酵母產(chǎn)生番茄紅素，具體步驟如下：(a)、工程菌的構(gòu)建從細(xì)菌噬夏孢歐文氏菌中克隆出crtE、crtB、crtI基因，根據(jù)密碼子兼并性進(jìn)行優(yōu)化，后進(jìn)行基因的全合成：分別插入甘油三磷酸脫氫酶、磷酸甘油激酶基因、產(chǎn)朊假絲酵母中P14基因啟動子和終止子之間，同時克隆巴斯德畢赤氏酵母rDNA基因片斷作為載體整合的基因片段，再克隆卡拉霉素G418基因片斷作為選擇性標(biāo)記；以PUC18為基礎(chǔ)分別將上述基因片斷連接在一起，構(gòu)成新的載體pucEBI；載體pucEBI經(jīng)SalI線性化用電擊轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤氏酵母工程菌；采用卡拉霉素G418篩選轉(zhuǎn)化子，出現(xiàn)紅色的菌落經(jīng)純化后得巴斯德畢赤氏酵母工程菌，然后進(jìn)一步進(jìn)行PCR和核酸印漬雜交鑒定；(b)、轉(zhuǎn)化子產(chǎn)番茄紅素的提取和進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)化子接種于由1％酵母抽提物、2％蛋白胨、2％葡萄糖、余量為水組成的培養(yǎng)基中，37℃、200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)四天后，經(jīng)5000轉(zhuǎn)離心后，凍干，采用酵母裂解酶裂解，用帶玻璃珠的丙酮抽提，再用石油醚抽提，抽提液再用真空干燥，干燥產(chǎn)物用甲醇和氯仿溶液溶解，溶解溶液用HPLC純化，純化樣品即番茄紅素用核磁共振進(jìn)行鑒定。 |
| 摘要 | 本發(fā)明是一種基因重組畢赤酵母生產(chǎn)番茄紅素的方法。其特征在于從細(xì)菌Erwinia uredovora中克隆出合成番茄紅素的三個關(guān)鍵基因CrtE、CrtB、CrtI，在巴斯德畢赤氏酵母中重建合成番茄紅素代謝流，使巴斯德畢赤氏酵母產(chǎn)生番茄紅素。斯德畢赤氏酵母菌(Pichia pastoris)FQR121，其保藏登記號為：CGMCC No.1257。本發(fā)明通過基因工程的手段，在巴斯德畢赤氏酵母中重建合成番茄紅素代謝流，使巴斯德畢赤氏酵母產(chǎn)生番茄紅素，采用基因工程巴斯德畢赤氏酵母能夠大量生產(chǎn)番茄紅素。 |
| 國際公布 |
