| 公開(公告)號 | CN1710072A |
| 公開(公告)日 | 2005.12.21 |
| 申請(專利)號 | CN200510025776.X |
| 申請日期 | 2005.05.12 |
| 專利名稱 | 分泌人白介素－2的重組卡介苗及其構(gòu)建方法 |
| 主分類號 | C12N15/09 |
| 分類號 | C12N15/09;C12N15/63;C12N15/26;A61K38/20;A61K39/00;C12Q1/68;A61P35/00;A61P31/06 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 上海交通大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 夏術(shù)階;劉海濤;孫曉文;凡 杰;張沂南 |
| 地址 | 200240上海市閔行區(qū)東川路800號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 上海交達(dá)專利事務(wù)所 |
| 代理人 | 毛翠瑩 |
| 國省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種分泌人白介素-2的重組卡介苗的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟：1)卡介苗穿梭表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)已有的卡介苗分泌抗原Ag85B信號肽和IL-2的基因序列，分別設(shè)計(jì)Ag85B信號肽和IL-2的擴(kuò)增引物，Ag85B信號肽的上下游酶切位點(diǎn)分別為BamHI和EcorI，IL-2的上下游酶切位點(diǎn)分別為EcorI和SalI，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別合成得到Ag85B信號肽和IL-2的基因片段，將Ag85B信號肽克隆到pMV261載體中，得到pMS，再將IL-2基因片段與pMS載體的信號肽連接，得到卡介苗穿梭表達(dá)載體pMSIL-2；2)卡介苗的培養(yǎng)：選取卡介苗為上海丹麥株，將卡介苗放在含有液體培養(yǎng)基的燒瓶中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基含有10％的營養(yǎng)劑ADC、0.5％吐溫80和0.2％甘油，搖床培養(yǎng)100轉(zhuǎn)/分，三周后卡介苗處于對數(shù)生長期，OD600值＝0.6，制得感受態(tài)卡介苗；3)電轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建重組卡介苗rBCGIL-2：在一離心管中混勻400μl含1×108cfu的感受態(tài)卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表達(dá)載體pMSIL-2，置于基因脈沖儀中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化得到陽性重組子，電轉(zhuǎn)參數(shù)：電壓為2500V，電流為25μF，電阻為1000Ω，陽性重組子先在含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基中篩選，培養(yǎng)兩周后得到陽性克隆rBCGIL-2，然后接種在含有50μg/ml卡那霉素的液體培養(yǎng)基搖床生長，大量培養(yǎng)；4)重組卡介苗rBCGIL-2的鑒定與功能檢測：進(jìn)行抗酸染色初步確定rBCGIL-2為抗酸桿菌，抽提rBCGIL-2質(zhì)粒DNA后，PCR擴(kuò)增得到IL-2的基因片段，Westernblotting檢測到rBCGIL-2培養(yǎng)上清中和菌體中有IL-2蛋白的表達(dá)，ELISA方法檢測到rBCGIL-2培養(yǎng)上清中有高含量的IL-2。 |
| 摘要 | 本發(fā)明涉及一種分泌人白介素-2的重組卡介苗rBCGIL-2及其構(gòu)建方法，利用基因工程技術(shù)將起分泌作用的卡介苗Ag85B信號肽片段和人IL-2的基因克隆至pMV261，得到卡介苗穿梭表達(dá)載體pMSIL-2，然后采用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將pMSIL-2導(dǎo)入BCG構(gòu)建重組卡介苗rBCGIL-2，依靠pMSIL-2在BCG的復(fù)制和信號肽的分泌作用，能夠高效分泌IL-2。本發(fā)明得到的重組卡介苗rBCGIL-2具有BCG和IL-2的雙重效果，能夠有效預(yù)防和治療淺表性膀胱腫瘤及結(jié)核��；利用重組卡介苗rBCGIL-2在膀胱腔內(nèi)的局部協(xié)同作用減少BCG和外用IL-2的用量，可以克服BCG治療的毒副作用。 |
| 國際公布 |
