公開(公告)號
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CN1710073A
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公開(公告)日
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2005.12.21
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申請(專利)號
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CN200510025777.4
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申請日期
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2005.05.12
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專利名稱
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分泌腫瘤壞死因子-α的重組卡介苗及其構(gòu)建方法
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主分類號
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C12N15/09
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分類號
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C12N15/09;C12N15/63;C12N15/28;C12N15/87;A61K38/17;A61K38/19;A61K39/00;C12Q1/68;A61P35/00;A61P31/06
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分案原申請?zhí)? |
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優(yōu)先權(quán)
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申請(專利權(quán))人
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上海交通大學
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發(fā)明(設(shè)計)人
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夏術(shù)階;劉海濤;孫曉文
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地址
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200240上海市閔行區(qū)東川路800號
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頒證日
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國際申請
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進入國家日期
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專利代理機構(gòu)
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上海交達專利事務(wù)所
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代理人
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毛翠瑩
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國省代碼
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上海;31
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主權(quán)項
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一種分泌腫瘤壞死因子-α的重組卡介苗的構(gòu)建方法,其特征在于包括下述步驟:1)卡介苗穿梭表達載體的構(gòu)建:分別設(shè)計Ag85B和TNF-α的擴增引物,Ag85B信號肽的上下游酶切位點分別為BamHI和EcorI,TNF-α的上下游酶切位點分別為EcorI和SalI,經(jīng)聚合酶鏈式反應(yīng)分別合成Ag85B信號肽和TNF-α基因片段,將Ag85B信號肽克隆到pMV261載體中,得到pMS,再將TNF-α基因片段與pMS載體的信號肽連接,得到穿梭表達載體pMSTNF-α;2)卡介苗的培養(yǎng):選取卡介苗為上海丹麥株,將卡介苗放在含有液體培養(yǎng)基的燒瓶中進行搖床培養(yǎng),液體培養(yǎng)基含有10%的營養(yǎng)劑ADC、0.5%吐溫80和0.2%甘油,搖床培養(yǎng)100轉(zhuǎn)/分,三周后卡介苗處于對數(shù)生長期,OD600值=0.6,制得感受態(tài)卡介苗;3)電轉(zhuǎn)化技術(shù)構(gòu)建分泌人TNF-α的重組卡介苗rBCGTNF-α:在一離心管中混勻400μl含1×108cfu的感受態(tài)卡介苗和2μl含0.4μg的穿梭表達質(zhì)粒pMSTNF-α,置于基因脈沖儀中進行電轉(zhuǎn)化得到陽性重組子,電轉(zhuǎn)參數(shù):電壓為2500V,電流為25μF,電阻為1000Ω,陽性重組子先在含有50μg/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基中篩選,培養(yǎng)兩周后得到陽性克隆rBCGTNF-α,然后接種在含有50μg/ml卡那霉素的液體培養(yǎng)基搖床生長,大量培養(yǎng);4)重組卡介苗rBCGTNF-α的鑒定與功能檢測:進行Z-N法抗酸染色證實為抗酸桿菌,抽提rBCGTNF-α質(zhì)粒DNA后,PCR擴增得到TNF-α基因片斷,WesternBlot檢測到rBCGTNF-α培養(yǎng)上清中和菌體中有TNF-α蛋白的表達,ELISA方法檢測到rBCGTNF-α培養(yǎng)上清中有高含量的TNF-α。
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摘要
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本發(fā)明涉及一種分泌腫瘤壞死因子-α的重組卡介苗及其構(gòu)建方法,利用基因工程技術(shù)將起分泌作用的卡介苗Ag85B信號肽和TNF-α的基因片段克隆至pMV261,得到卡介苗穿梭表達載體pMSTNF-α,然后采用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將pMSTNF-α導入BCG構(gòu)建重組卡介苗rBCGTNF-α,依靠pMSTNF-α在BCG的復制和信號肽的分泌作用,能夠高效分泌TNF-α。本發(fā)明得到的重組卡介苗rBCGTNF-α具有BCG和TNF-α的雙重效果,能夠有效預(yù)防和治療淺表性膀胱腫瘤;利用重組卡介苗rBCGTNF-α在膀胱腔內(nèi)的局部協(xié)同作用減少BCG和外用TNF-α的用量,可以克服BCG治療的毒副作用。
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國際公布
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