| 公開(公告)號 | CN1594582A |
| 公開(公告)日 | 2005.03.16 |
| 申請(專利)號 | CN200410025580 |
| 申請日期 | 2004.06.30 |
| 專利名稱 | 一種制備人載脂蛋白A-Ⅰ的方法 |
| 主分類號 | C12N15/63 |
| 分類號 | C12N15/63;C12N15/12;C12N15/81;C12N1/19;C12P21/02;C07K1/14 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 復(fù)旦大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計)人 | 吳滿平;宋大新;周佩;鐘江;趙志安 |
| 地址 | 200433上海市邯鄲路220號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進入國家日期 | |
| 專利代理機構(gòu) | 上海正旦專利代理有限公司 |
| 代理人 | 包兆宜 |
| 國省代碼 | 上海;31 |
| 主權(quán)項 | 一種制備人載脂蛋白A-I的方法，其特征是將apoA-I基因裝入P.pastoris的分泌型表達載體上，線性化后轉(zhuǎn)化P.pastoris甲醇酵母宿主菌，利用重組菌進行高效表達，用冷丙酮分級沉淀后經(jīng)Q-Sepharose柱進一步分離，得到電泳純的ApoA-I蛋白，包括下述步驟：1)構(gòu)建重組質(zhì)粒以昆蟲表達系統(tǒng)的表達質(zhì)粒DNA為模板通過PCR擴增獲天然apoA-I基因片段，在apoA-I基因編碼序列的5’端和3’端分別引入酶切位點XholI和EcoRI，雙酶切后裝入P.pastoris的分泌性表達載體上，獲得重組表達質(zhì)粒；2)構(gòu)建ApoA-I表達菌株步驟1)的重組質(zhì)粒用BglII線性化，電轉(zhuǎn)化宿主細胞，轉(zhuǎn)化液涂于MD平板，28-30℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子長出；3)篩選高表達菌株步驟2)的轉(zhuǎn)化子經(jīng)G418抗性篩選，獲得抗4mg/mlG418的高抗性菌株，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)獲得高表達菌株；4)發(fā)酵、培養(yǎng)、分離ApoA-I蛋白步驟3)的高表達菌株發(fā)酵在優(yōu)化后的BMGY內(nèi)生長，誘導(dǎo)ApoA-I產(chǎn)生，上清液經(jīng)丙酮分級沉淀、Q-Sepharose分離純化，獲純的ApoA-I蛋白。 |
| 摘要 | 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種制備人載脂蛋白A-I(ApoA-I)的方法。具體涉及利用畢赤酵母系統(tǒng)，通過構(gòu)建重組工程菌株、表達、分離純化獲得高效生產(chǎn)人載脂蛋白A-I的方法。本發(fā)明通過基因工程手段將來源于天然的apoA-I基因重組至P.pastoris宿主菌，表達水平可高達200mg/L，表達產(chǎn)物經(jīng)冷丙酮分級沉淀和-Sepharose分離純化獲得電泳純的ApoA-I蛋白。經(jīng)Western-blot鑒定、蛋白質(zhì)譜檢測、N端氨基酸測序、細胞結(jié)合活性測定均與人血來源的ApoA-I蛋白一致。 |
| 國際公布 |
