| 公開(公告)號 | CN1560261A |
| 公開(公告)日 | 2005.01.05 |
| 申請(專利)號 | CN200410016758.0 |
| 申請日期 | 2004.03.02 |
| 專利名稱 | 含乳鐵蛋白及其肽的全蠶蛹粉的生產(chǎn)方法 |
| 主分類號 | C12N15/86 |
| 分類號 | C12N15/86;A23K1/16;A61K35/64;A61P1/12 |
| 分案原申請?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(專利權(quán))人 | 浙江大學(xué) |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 汪以真;許梓榮;黃海青 |
| 地址 | 310027浙江省杭州市西湖區(qū)玉古路20號 |
| 頒證日 | |
| 國際申請 | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | 杭州求是專利事務(wù)所有限公司 |
| 代理人 | 韓介梅 |
| 國省代碼 | 浙江;33 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 含乳鐵蛋白及其肽的全蠶蛹粉的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：1)取泌乳母畜乳腺腺泡，液氮冷凍，研磨成粉末，提取總RNA并通過反轉(zhuǎn)錄得到乳鐵蛋白或乳鐵蛋白肽的cDNA，根據(jù)乳鐵蛋白或乳鐵蛋白肽基因特征設(shè)計(jì)一對各帶一個(gè)酶切位點(diǎn)的引物，利用RT-PCR技術(shù)得到DNA，定向克隆入大腸桿菌克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株，篩選陽性克��；2)將以上篩選出的陽性菌株抽提質(zhì)粒，用DNA內(nèi)切酶切出目的基因并純化之，將目的基因定向克隆進(jìn)桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體，得到含乳鐵蛋白重組轉(zhuǎn)移載體，同時(shí)線性化桿狀病毒表達(dá)載體，在透明的聚苯乙烯滅菌管中加入下列試劑：濃度0μg/μL的重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體15.0μl、濃度0μg/μL線性化的桿狀病毒表達(dá)載體0μL、滅菌水10.0μL、脂質(zhì)體14.0μL，輕輕混勻，常溫下放置15分鐘，在此期間待轉(zhuǎn)染的家蠶細(xì)胞吸去培養(yǎng)基，用無血清TC-100培養(yǎng)基洗三次，最后加入2mL無血清TC-100培養(yǎng)基，15分鐘以后，用移液器吸取上述40.0μL共轉(zhuǎn)染試劑，分三處滴入細(xì)胞中，輕輕搖勻，然后用封口膜密封，27℃培養(yǎng)5天；3)待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)液，將母液按10-3、10-4、10-5的濃度梯度進(jìn)行稀釋，吸取1μL的病毒稀釋液接種到貼壁細(xì)胞中，搖動使之均勻，27℃感染1小時(shí)后，移去接種液，在病毒接種時(shí)將3％低熔點(diǎn)瓊脂糖熔化，保溫在40℃水浴中，然后與等體積預(yù)熱到40℃的含20％胎牛血清2×TC-100快速混合均勻，將此混合液輕輕加到已移走接種液的貼壁細(xì)胞上，等膠凝固后封口，逐日觀察病毒斑生長情況，當(dāng)病毒斑明顯后，在顯微鏡下挑取分隔良好的12個(gè)病毒斑，接種于5×104細(xì)胞密度且已貼壁生長的24孔板中，至細(xì)胞呈感染態(tài)時(shí)，收集病毒液，向殘余的細(xì)胞中添加100μgX-gal的溶液，37℃溫育1小時(shí)后，選取白斑按上述步驟3進(jìn)一步篩選，重復(fù)篩選至獲得含乳鐵蛋白或乳鐵蛋白肽基因的重組桿狀病毒；4)將純化的重組病毒穿刺家蠶蠶蛹，26-30℃放置，待蠶蛹發(fā)病后收集病蠶蛹，勻漿，50℃烘干制成蠶蛹粉。 |
| 摘要 | 本發(fā)明的含乳鐵蛋白及其肽的全蠶蛹粉的生產(chǎn)方法是采用桿狀病毒為載體，以家蠶蠶蛹為宿主生產(chǎn)與天然乳鐵蛋白及其肽生物學(xué)活性相似的基因工程產(chǎn)品的。其生產(chǎn)、使用過程安全，不存在對人畜和環(huán)境的潛在危險(xiǎn)。將本發(fā)明生產(chǎn)的全蠶蛹粉用作飼料添加劑，在補(bǔ)充飼料蛋白的同時(shí)起到殺菌抗病毒、提高動物自身的免疫力的作用，可有效地防治斷乳仔豬的腹瀉，以生產(chǎn)出無抗生素殘留的高品質(zhì)畜產(chǎn)品。 |
| 國際公布 |
