| 公開(公告)號(hào) | CN1236071C |
| 公開(公告)日 | 2006.01.11 |
| 申請(qǐng)(專利)號(hào) | CN200410006374.0 |
| 申請(qǐng)日期 | 2004.03.01 |
| 專利名稱 | 高特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)鑒別中藥材烏梢蛇真?zhèn)蔚姆椒? |
| 主分類號(hào) | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分類號(hào) | C12Q1/68(2006.01)I |
| 分案原申請(qǐng)?zhí)? | |
| 優(yōu)先權(quán) | |
| 申請(qǐng)(專利權(quán))人 | 中國中醫(yī)研究院中藥研究所 |
| 發(fā)明(設(shè)計(jì))人 | 黃璐琦;馮成強(qiáng);唐曉晶 |
| 地址 | 100700北京市東直門內(nèi)南小街16號(hào) |
| 頒證日 | |
| 國際申請(qǐng) | |
| 進(jìn)入國家日期 | |
| 專利代理機(jī)構(gòu) | |
| 代理人 | |
| 國省代碼 | 北京;11 |
| 主權(quán)項(xiàng) | 一種高特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)鑒別真?zhèn)螢跎疑叩姆椒�，其特征在于包括DNA模板提取、PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)三個(gè)步驟；①模板DNA的提�。哼x取無霉變和蟲蛀的藥材肌肉部分1g，置于研缽中經(jīng)液氮速凍后研成粉末，將粉末速轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，加入6mL已滅菌的勻漿緩沖液，勻漿緩沖液由蔗糖0.25mol/L，Tris-Hcl10mmol/LPH＝8.0，Na2EDTA1mmol/LPH＝8.0組成，加入蛋白酶K至終濃度為150μg/mL，再加入10％SDS至終濃度為0.8％；55℃水浴3-4小時(shí)，其間輕搖數(shù)次，取出冰浴至4℃，400g離心5分鐘，取上清液，加入等體積Tris飽和酚抽提，混勻10分鐘，兩相成乳狀，5000g離心15分鐘，取上層水相，重復(fù)一次，再用CHCl3抽提兩次，CHCl3抽提離心后取上層水相加入兩倍無水乙醇沉淀DNA，-20℃冰箱中過夜；第二天取出，5500g離心15分鐘，沉淀物用70％乙醇洗滌兩次，室溫?fù)]干乙醇，用適量TE溶解DNA，-20℃?zhèn)溆茫虎赑CR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系30μl含10mmol/lTris-HClPH＝8.0，50mmol/lKCl，0.1％TritonX-100，1.5mmol/lMgCl2，1.5mmol/1dNTPs，兩種高度特異性鑒別引物HWL-1即5’-GCGAAAG-CTCGACCTAGCAAGGGGACCACA-3’和HWH-1即5’-CAGGCTCCTCTA-GGTTGTTATGGGGTACCG-3’，各10pmol/L，DNA模板約100ng，反應(yīng)在PTC-100基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增；循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性4分鐘；95℃變性40秒，65℃退火1分鐘，72℃延伸30秒；10個(gè)循環(huán)；95℃變性40秒，60℃退火1分鐘，72℃延伸30秒；15個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘；③電泳檢測(cè)：PCR實(shí)驗(yàn)中設(shè)置無模板DNA的陰性對(duì)照，反應(yīng)完成后，取5μL反應(yīng)液經(jīng)溴化乙錠染色，1.8％瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像觀察，在310bp-320bp范圍內(nèi)處擴(kuò)增出明亮唯一條帶的樣品即為正品烏梢蛇，混淆品均應(yīng)無任何條帶出現(xiàn)。 |
| 摘要 | 本發(fā)明是利用DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)鑒別中藥材烏梢蛇真?zhèn)蔚姆椒�。設(shè)計(jì)了一對(duì)高特異性鑒別引物，通過高特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)鑒別中藥材烏梢蛇與市場(chǎng)上常見的偽品：滑鼠蛇、黑眉錦蛇、紅點(diǎn)錦蛇、王錦蛇、赤鏈華游蛇、玉斑錦蛇、赤鏈蛇、灰鼠蛇、眼鏡蛇、三索錦蛇。使用此方法鑒別烏梢蛇的真?zhèn)危煌ㄟ^簡單的烏梢蛇及其偽品的DNA提取、PCR特異性擴(kuò)增、電泳檢測(cè)三步即可完成對(duì)藥材真?zhèn)蔚蔫b別。操作簡單、易于掌握、準(zhǔn)確性高。 |
| 國際公布 |
