一 基本原理
(一)光的基本知識(shí)
光是由光量子組成的,具有二重性,即不連續(xù)的微粒性和連續(xù)的波動(dòng)性。波長和頻率是光的波動(dòng)性的特征,可用下式表示:λ=c/v
式中λ為波長,具有相同的振動(dòng)相位的相鄰兩點(diǎn)間的距離叫波長。v為頻率,即每秒鐘振動(dòng)次數(shù)。c為光速,等于299770±4km/s。
光屬于電磁波,自然界中存在各種不同波長的電磁波,分光光度法所使用的光譜范圍在200nm~10μm(1μm=1000nm)之間。其中200~400nm為紫外光區(qū),400~760nm為可見光區(qū),760~10 000nm為紅外光區(qū)。
可見光區(qū)的電磁波,因波長不同而呈現(xiàn)不同的顏色,這些不同顏色的電磁波稱為單色光,單色光并非單一波長的光,而是一定波長范圍內(nèi)的光,太陽及鎢絲燈發(fā)出的白光,是各種單色光的混合光(復(fù)合光),利用棱鏡可將白光分成按波長順序排列的各種單色光,即紅、橙、黃、綠、青、藍(lán)、紫等,這就是光譜。
一切物質(zhì)都會(huì)對某些波長的光進(jìn)行吸收,而物質(zhì)對不同波長的射線,表現(xiàn)為不同的吸收現(xiàn)象,這一性質(zhì)稱為選擇性吸收。有色溶液之所以呈現(xiàn)不同顏色,就是由于這種對光的選擇性吸收所致。某些無色物質(zhì)雖對可見光無吸收作用,但也能選擇性地吸收在可見光范圍外的部分光能,即可吸收特定波長的紫外線或紅外線。物質(zhì)的吸收光譜與它們本身的分子結(jié)構(gòu)有關(guān),不同物質(zhì)由于其分子結(jié)構(gòu)不同,對不同波長光線的吸收能力也不同,因此每種物質(zhì)都具有其特異的吸收光譜,在一定條件下,其吸收程度與該物質(zhì)濃度成正比,故可利用各種物質(zhì)的不同的吸收光譜特征及其強(qiáng)度對不同物質(zhì)進(jìn)行定性和定量的分析。吸收光譜的測定可用來檢測各種不同的物質(zhì)。
分光光度技術(shù),主要是利用物質(zhì)特有的吸收光譜來鑒定物質(zhì)性質(zhì)及含量的技術(shù),其理論依據(jù)是Lamber和Beer定律。
(二)朗伯-比爾(Lamber-Beer)定律
朗伯-比爾定律是比色分析的基本原理,此定律是討論有色溶液對單色光的吸收程度與溶液的濃度及液層厚度間的定量關(guān)系。是由朗伯定律和比爾定律歸納而得。
1.朗伯定律 一束單色光通過溶液后,由于溶液吸收了一部分光能,光的強(qiáng)度就要減弱,若溶液濃度不變,則溶液的厚度愈大(即光在溶液中所經(jīng)過的途徑愈長),光的強(qiáng)度減低也愈顯著。即吸光度與溶液層的厚度成正比。
A=K1L
式中K1為吸光系數(shù),其值取決于入射光的波長,溶液的性質(zhì)、濃度及溫度等。L為溶液的厚度(cm)
上式表明,當(dāng)溶液的濃度不變時(shí),吸光度與溶液液層的厚度成正比,這就是朗伯定律。
2.比爾定律 當(dāng)一束單色光通過有色溶液后,溶液液層的厚度不變而濃度不同時(shí),溶液的濃度愈大,則透射光的強(qiáng)度愈弱,即吸光度與溶液的濃度成正比。
A=K2C
式中C為有色物質(zhì)溶液的濃度;K2吸光系數(shù),其值取決于入射光的波長,溶液的性質(zhì)和液層的厚度,以及溶液的溫度等。
上式表明,當(dāng)溶液液層的厚度不變時(shí),吸光度與溶液的濃度成正比,這就是比爾定律。
3.朗伯-比爾定律 如果同時(shí)考慮吸收層的厚度和溶液濃度對光吸收的影響,則必須將朗伯定律和比爾定律合并起來,得A=KLC即吸光度與溶液的濃度和液層的厚度的乘積成正比,這就是朗伯-比爾定律。
在上式中,若L用厘米表示,C用克/升表示,則比例常數(shù)K稱為吸光系數(shù),其值取決于入射光的波長,溶液的性質(zhì)和溫度等,而與光的強(qiáng)度、溶液的濃度及液層的厚度無關(guān)。
若L用厘米表示,C用摩爾/升表示,則上式中的比例常數(shù)用K表示,得到A=LC式中稱為物質(zhì)的摩爾吸光率或摩爾吸光系數(shù),其他相當(dāng)于L=1cm,C=1mol/L時(shí),在一定波長下的吸光度,它是物質(zhì)的特性常數(shù)。
不同的物質(zhì)可能會(huì)有相同的最大吸收波長,但其摩爾吸光系數(shù)不一定相同。值愈大,說明該物質(zhì)溶液對光吸收愈強(qiáng)烈,則比色測定的靈敏度愈高。