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四 分光光度法的誤差
在分光光度法中，即使將各種因素都控制好，對于濃度過大或過小的樣品，誤差仍然很大。因為濃度過大的樣品，其吸光度過高，影響檢測器的靈敏度，且讀數(shù)標尺刻度的精度差，誤差亦大。濃度過低的樣品，其吸光度小，則因與儀器本身因素有關(guān)，也容易引起檢測器標尺上的讀數(shù)誤差。例如光源波動的影響：當光源強度改變１％、吸光度為1.0時，只有0.4%的誤差，但在吸光度為0.045時，則可產(chǎn)生9.6%的誤差。實際上，在整個透光度（或吸光度)范圍的不同部分均有不同的誤差。從理論上推算，相對誤差最小的部分在透光度為３36.8%處（或吸光度為0.4343處)，故通常認為測定值在吸光度0.20～0.80范圍內(nèi)（透光度為20%～65%)誤差較小，超出此范圍，相對誤差均會增大。
影響分光光度法精確度的主要原因還有光譜純度。分光光度計應(yīng)能正確選出光源光譜中所需部分波長作為入射光，一般應(yīng)保持光譜帶寬度在10nm以下，如果測定樣品有很狹窄的吸收峰，就必須有更小的光譜寬度，所以分光光度計大多均有可調(diào)的狹縫。
散射光也是引起誤差的重要因素。這里所說的散射光是指一切未經(jīng)過測定溶液吸收，而又落到檢測器上引起干擾的光，如室內(nèi)自然光，經(jīng)過某些漏洞進入儀器而明顯增大了透光度，故高靈敏度的分光光度計宜安裝光線較暗的室內(nèi)。散射光也包括能透過比色皿的非測定需要的其他波長的光，實際上是光譜不純，但因效果與散射光一樣，故也稱為散射光干擾。散射光干擾對高濃度測定特別有害，能使吸光度降低，標準曲線的高濃度部分向下彎曲。
五 常見國產(chǎn)分光光度計的使用
(一)721型分光光度計
這是一種采用光電管為受光器的較高級可見光分光光度計，其波長范圍為360～800nm，在410～710nm之間的靈敏度較好。
使用方法如下：
１．靈敏度選擇鈕放在“１”檔（如調(diào)不到“０”時選用較高的檔)。
２．轉(zhuǎn)動波長選擇鈕，選用所需的波長。
３．接通電源（指示燈亮)。
４．揭開比色杯暗箱蓋，轉(zhuǎn)動“０”電位鈕使電表指針對準Ｔ＝０處。
５．將比色杯放入比色杯架，使空白管對向光路，蓋好比色杯暗箱蓋。轉(zhuǎn)動“100”電位鈕，調(diào)準電表指針使之指向Ａ＝０（Ｔ＝100)處。
６．拉動比色杯架的拉桿，使測定杯依次進入光路，迅速從電表上讀取吸光度值，記錄。
７．比色完畢后，關(guān)上電源開關(guān)，取出比色杯，將比色杯暗箱蓋好，清洗比色杯并晾干。
(二)722型分光光度計
本儀器是可見光分光光度計，
其波長范圍為360～800nm，具有測量被測溶液透光率（Ｔ)值，吸光度（Ａ)值，濃度直讀，模擬信號輸出等功能。
使用方法如下：
１．儀器預熱 儀器開機后燈及電子部件需預熱平衡，故應(yīng)預熱30min，此時樣品室蓋應(yīng)打開。
２．調(diào)節(jié)波長 用波長調(diào)節(jié)鈕調(diào)至所需波長處。
３．調(diào)置滿度、調(diào)零 將空白溶液的比色杯放在試樣槽架第一格，其余格放待測溶液的比色杯，此時空白溶液對準光路。蓋上樣品室蓋，按MODE鍵，使TRNAS指示燈亮，然后按100%Ｔ鍵，示窗能自動調(diào)整透射比為100.0（一次有誤時可加按一次)。
４．打開樣品室蓋， 示窗能自動調(diào)整透射比為0.000，連續(xù)重復２～３次即可。
5. 按MODE鍵，使ABS指示燈亮，此時空白液對應(yīng)的吸光度應(yīng)為0.000。拉動拉桿，當拉桿到位時有定位感，即可在顯示窗上分別讀取各自的吸光度值。
6．測定完畢后，先打開樣品室蓋，再斷電源。比色杯應(yīng)清洗干凈后，再貯放保存。
7．濃度直讀 按MODE鍵，使CONC指示燈亮，將已標定濃度的溶液移入光路，按下濃度調(diào)節(jié)鍵（↑100%Ｔ鍵和0%Ｔ鍵↓)，使數(shù)字顯示為標定值，將被測溶液移入光路，即可讀出相應(yīng)濃度值。
(三)使用分光光度計時的注意事項
１．分光光度計必須放置在固定而且不受振動的儀器臺上，不能隨意搬動，嚴防振動，潮濕和強光直射。
２．比色杯盛液量以達到杯容積２／３左右為宜。若不慎將溶液流到比色杯的外表面，則必須先用濾紙吸干，再用擦鏡紙或綢布擦凈，然后才能把比色杯放入比色杯槽內(nèi)。移動比色杯槽要輕，以防溶液濺出，腐蝕機件。
３．不可用手拿比色杯的光學面，禁止用毛刷等物摩擦比色杯的光滑面。
４．用完比色杯后應(yīng)立即用自來水沖洗，再用蒸餾水洗凈。若用上法洗不凈時，可用５％的中性皂溶液或洗衣粉稀釋浸泡，也可用新配制的重鉻酸鉀－硫酸洗液短時間浸泡，之后立即用水沖洗干凈。洗滌后應(yīng)把比色杯倒置涼干或用濾紙條將水吸去，再用擦鏡紙輕輕揩干。
５．一般應(yīng)把溶液濃度盡量控制在吸光度值0.1～0.7的范圍內(nèi)進行測定。這樣所測得的讀數(shù)誤差較小。如吸光度不在此范圍內(nèi)，可調(diào)節(jié)比色液濃度，適當稀釋或加濃，使其在儀器準確度較高的范圍內(nèi)進行測定。
６．儀器連續(xù)使用時間不應(yīng)超過2h，每次使用后需要間歇半小時以上才能再用。
７．每套分光光度計上的比色杯及比色杯槽不得隨意更換。
８．分光光度計內(nèi)放有硅膠干燥袋，需定期更換。
