一、血管壁細(xì)胞提取
1.以無菌術(shù)取動(dòng)脈,立即放入4℃、5%水解乳蛋白Hanks液中漂洗,除去凝血。
2.用小鑷剔除外膜纖維、脂肪組織,用剪子沿血管壁縱向剪開血管,用Hanks液洗2次。
3.可先分開內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞,也可不區(qū)分兩類細(xì)胞,將血管切成小塊,放入2%膠原酶,溫浴12~18h。
4.梯度液選擇40%~70%,40%梯度液應(yīng)是4份precoll、1份小牛血清、5份BPS,其他濃度配制與此相同。
5.把密度梯度液按從管底至管口密度梯度逐漸減少的順序鋪入試管,將操作3.細(xì)胞液鋪于頂層,4kr/min離心,收集各層細(xì)胞鑒定。
二、細(xì)胞核提取
1.取制備血管細(xì)胞懸液放于試管中,加五倍體積緩沖液(10mmol/l Trispayment-defi.com/yishi/HCL,pH7.4含10mol/L NaCl,1.5mmol/L Mgcl2),加1%SDS10 μl用勻漿器輕輕勻漿。
2. 加蔗糖液(0.34mol/L,蔗糖10mol/LMgCl2)2份再勻漿1次,下面鋪一層0.88mol/L蔗糖,800g離心5min,收集沉淀部分。
3.在0.88mol/L蔗糖液中再純化1次,然后將細(xì)胞懸于10ml蔗糖液(0.34mol/L0.05mmol.LMgCl2)液中,用超聲波處理10S。
4.將兩倍體積的0.88mol/L蔗糖加于上述處理液中,800g離心30min收集沉淀部分。
5.將沉淀加入0.88mol/L蔗糖,5kg離心1h,沉淀部分為細(xì)胞核,將其保存于0.25mol/L蔗糖,0.55mmol/LMgCl中備用。
三、細(xì)胞膜的提取
1.取一定量酶處理的細(xì)胞,用勻漿器破碎,操作要溫和,使細(xì)胞膜保持完整。由于水與膜的疏水部分之間有反應(yīng),因此要精確掌握分離介質(zhì)中的離心強(qiáng)度和滲透壓,以每克細(xì)胞濕重加40ml介質(zhì)。
2.用Potter-Elvehiem勻漿器,桿與壁間間隙0.5~0.6μm,14.4kr/min上下勻漿4~6次,每次5S。
3.過濾勻漿液,150g離心10min,保留上清,沉淀部分加入50μl介質(zhì),用勻漿器1kr/min勻漿3次,150g離心10min,沉淀部分再加入上次勻漿的上清液。
4.合并3次上清液,2kg離心10min,棄上清,沉淀部分溶于100μl介質(zhì),離心10min,棄上清,留沉淀。
5.將沉淀部分加入70%蔗糖15份,然后分別置于三個(gè)離心管中,上面依次疊加54%、49%、45%,41%,37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。
6.700kg離心90min,分離介質(zhì)在1.16~1.18之間形成介面。
7.收集d為1.16~1.18g/ml之間的細(xì)胞膜,加30倍的介質(zhì)以2.5kg離心10min,洗滌2次。
8.保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5緩沖液中,用于細(xì)胞膜的研究分析。
四、溶酶體的分離
1.在梯度混合器的兩個(gè)小杯中分別加入2.1mol/L和1.1mol/L蔗糖(比例9:1)。
2.收集血管壁細(xì)胞,用特制勻漿器1kr/min勻漿10次。
3.以150g離心10min,上清液以同樣條件離心1次,棄沉淀,上清液以9kg離心3min棄上清液,
4.沉淀分三種不同顏色,褐色為半純化的溶酶體,中間黃褐色為線粒體部分,上層白色為膜成分混合物。首先小心吸取上層,然后加入0.3mol/L蔗糖數(shù)毫升,慢慢搖勻使界面層懸浮,再用0.3mol/L蔗糖洗1次。
5.將懸浮的半純化溶酶體鋪在梯度平面上,用玻棒攪勻最上層梯度液,使溶酶體和梯度液之間的介面破壞,然后以10kg離心15min,離心后可出現(xiàn)三條明顯的區(qū)帶及少許沉淀,最下面黃褐色為純化的溶酶體,中間黃色的為線粒體。
五、線粒體的分離
1.漿分離的血管浸入緩沖液(250mmol/L甘露醇、0.5mpayment-defi.com/sanji/mol/l EDTA、 5mmol/L Hepes、0.1%BSA、pH7.4)勻漿破碎細(xì)胞,600g離心5min,除去細(xì)胞核及碎片。
2.上清液在100kg離心10min,留取沉淀部分。
3.將沉淀部分懸浮于5ml操作1.的緩沖液中,加入5倍體積30%Percon、225mmol/L甘露醇、1mmol/L,EDTA、25mmol/LHepes 0.1%BSA,5000g離心30min。
4.將上述沉淀溶于適量10mmol/L KH2PO4,pH7.4中,輕輕振蕩15min。
5.加入10ml蔗糖液緩沖液(32%蔗糖、30%甘油、10mmol/l MgCl2、10mmol/L KH2PO4,pH7.4)振蕩15min。
6.用BransonB-12超聲波碎儀60~70W處理2次,每次15min,12kg離心10min。
7.將沉淀部分溶于10倍體積緩沖液中并鋪于試管底層,試管中層鋪成不連續(xù)蔗糖梯度(25.3%、37.9%和51.3%)蔗糖各4mm厚,上層鋪上清液。
8.2kg離心3h,在25.3%/37.9%界面處為線粒體外膜,在51.3%蔗糖層分別回收內(nèi)膜和基質(zhì)。