Apo（a)是一結(jié)構(gòu)復(fù)雜的糖蛋白，Lp（a)特征性的蛋白成分，占Lp（a)的20%。Apo（a)含糖量30%～35%，通過(guò)一個(gè)或多個(gè)二硫鍵與ApoB100相連。Apo（a)分子量在250000～800000之間，是目前所發(fā)現(xiàn)的最具多態(tài)性的人類蛋白質(zhì)。Apo（a)多態(tài)性產(chǎn)生的原因在于其肽鏈長(zhǎng)度不等而且糖基化程度不同；這是由于Apo（a)基因中Kringle-4結(jié)構(gòu)重復(fù)的數(shù)量差異所致，在不同個(gè)體中重復(fù)10～40次不等。
起初Utermann等通過(guò)家系研究發(fā)現(xiàn)Apo（a)多態(tài)性受Apo（a)基因位點(diǎn)上的一組等位基因所控制，認(rèn)為這種多態(tài)性以常染色體顯性方式遺傳。近來(lái)運(yùn)用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP)等方法證明Apo（a)是以孟德?tīng)柟诧@性方式進(jìn)行遺傳的。隨著檢測(cè)方法的改進(jìn)，報(bào)道控制Apo（a)多態(tài)性的等位基因數(shù)目越來(lái)越多。目前已發(fā)現(xiàn)Apo（a)等位基因位點(diǎn)中至少有34個(gè)等位基因與其多態(tài)性有關(guān)。鑒于高Lp（a)是心腦血管疾病（CCVD)的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，與Apo（a)作用密切相關(guān)。故檢測(cè)Apo（a)多態(tài)性表型在不同人群中的分布對(duì)CCVD的預(yù)測(cè)及防治具有重要意義。
Apo（a)表型檢測(cè)方法主要有兩大類，一類應(yīng)用SDS-PAGE分離載脂蛋白，然后結(jié)合免疫印跡技術(shù)檢測(cè)不同Apo（a)表型；另一類方法的不同之處在于用SDS-agarose（瓊脂糖)電泳代替SDS-PAGE分離載脂蛋白，使檢測(cè)分辨率大為提高。
Utermann等（1987)應(yīng)用-SDS垂直板PAGE結(jié)合免疫印技術(shù)，檢出6種Apo（a)異構(gòu)體，共14種臨床表型。應(yīng)用此法僅有50%受試者可檢出Apo（a)異構(gòu)體區(qū)帶，Kraft等（1988)將上法垂直板電泳槽改為水平板式，避免了帶型之間污染問(wèn)題且使方法更適合于大批量標(biāo)本檢測(cè)。Huang等（1991)將生物素-親和素放大技術(shù)引入U(xiǎn)termann法免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)，使檢測(cè)靈敏感大大提高，88%的受試者均可檢出Apo（a)異構(gòu)體區(qū)帶。1990年Gaubatz等應(yīng)用含0.75%agarose的SDS-PAGE結(jié)合免疫印跡技術(shù)，發(fā)現(xiàn)美國(guó)人中共有在11種Apo（a)異構(gòu)體，共32種表型。僅有1%受試者未檢出任何一種Apo（a)異構(gòu)體。
Kamboh等（1991)報(bào)道應(yīng)用SDS-agarose電泳結(jié)合免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Apo（a)表型的方法，檢出23種不同Apo（a)異構(gòu)體，共115種表型。Geroldi等（1993)將Kamboh法加以改良，以毛細(xì)管印跡（capillary blottiog)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的電轉(zhuǎn)移法，并用聚偏二氟乙烯（PVDF)膜代替?zhèn)鹘y(tǒng)的硝酸纖維素（NC)膜，使檢測(cè)方法更為簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，更適合于大規(guī)模人群調(diào)查。Marcovina等（1993)應(yīng)用SDS-1.5%agarose凝膠電泳結(jié)合免疫印跡技術(shù)，首次報(bào)道人類至少有35種Apo（a)異構(gòu)體，此法是在Kamboh等法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種高分辨的新分析方法。
上述兩類方法有許多相似之處，即首先采用電泳技術(shù)將Apo（a)與其他載脂蛋白分離，然后應(yīng)用轉(zhuǎn)移免疫印跡技術(shù)（Western immunoblotting)，靈敏而特異地顯示Apo（a)多態(tài)區(qū)帶的位置，最后根據(jù)其與ApoB100電泳速率比較或根據(jù)其分子量大小而確定Apo（a)表型。
檢測(cè)Apo（a)表型的方法中，以Utermann法或其改良法最為常用。這類方法先用SDS-PAGE分離Apo（a)異構(gòu)體，然后用特異的多克隆或單克隆抗體作免疫印跡顯示。
1．儀器與試劑
電泳儀，夾心式垂直板電泳槽及凝膠轉(zhuǎn)移電泳槽，NC膜（孔徑0.45μm,轉(zhuǎn)移電泳用)；高分子量系列蛋白標(biāo)準(zhǔn)（MW67000～669000，Pharmacia產(chǎn)品)；ApoB100純品；主要試劑有：①30%丙烯酰胺貯存液；②電泳緩沖液為pH8.3，內(nèi)含0.1%SDS的0.025mol/lTris-0.192mol/L甘氨酸溶液；③轉(zhuǎn)移電泳緩沖液為pH8.3，內(nèi)含20%甲醇的0.02mol/lTris～0.15mol/L甘氨酸溶液；④樣品處理緩沖液：50g/l SDS水溶液4ml，β-疏基乙醇800μl，750ml/L甘油溶液800μl，10g/L溴酚藍(lán)溶液200μl混合；⑤洗滌緩沖液為pH7.4內(nèi)含9g/L的0.01mol/lTris-HCl溶液；⑥封閉液為內(nèi)含50g/L去脂奶粉（或含10g/L小牛血清白蛋白)的洗滌緩沖液；⑦第一抗體為羊抗人Apo（a)血清；⑧第二抗體作為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗羊IgG；⑨底物溶液為脂溶性4-氯-1-萘酚底物液或水溶性二氨基聯(lián)苯胺（DAB)底物液。
2．實(shí)驗(yàn)方法
①凝膠板制備：按照說(shuō)明書(shū)安裝好垂直板電泳槽，參照Utermann等方法配制6.6%聚丙烯酰胺分離膠和3.6%濃縮膠制備膠板；②電泳：血清樣品18μl與100μl新鮮配制樣品處理緩沖液混勻，置100℃水浴10min，冷卻，取此混合物20μl加入樣品槽中并覆以電泳緩沖液，ApoB100與高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)處理，除不加β-巰基乙醇其他操作同前。在上下槽注入電泳緩沖液，接通電源（上槽按負(fù)極，下槽接正極)待溴酚藍(lán)跑出凝膠下沿2h即可結(jié)束電泳（通常120V電泳6h)；③轉(zhuǎn)移電泳：取此凝膠，切下分子量蛋白帶放入SDS洗脫液中過(guò)夜，以固定凝膠大小并洗脫掉未與蛋白結(jié)合的SDS，0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250染色室溫1h，7%乙酸脫去背景顏色。剩余凝膠鋪在已浸過(guò)轉(zhuǎn)移電泳緩沖液的NC膜上，在凝膠NC膜外再覆以3mm厚的濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移電泳緩沖浸濕)，將此濾紙/凝膠/NC膜/濾紙一同放在電泳轉(zhuǎn)移支架上，按層次相夾置于裝滿轉(zhuǎn)移電泳緩沖液的電泳槽中，接通電源（凝膠面對(duì)負(fù)構(gòu)，NC膜面對(duì)正極)。120V電泳6h（30℃以下)或4℃30V轉(zhuǎn)移過(guò)夜；④免疫印跡分析：取出轉(zhuǎn)移后的NC膜在洗滌液中洗3次后，置封閉液中室溫封閉3h（或37℃1h)，在洗滌液中洗3次，加入1：100稀釋的第一抗體并充分混勻，37℃溫浴6h（或過(guò)夜)，隨后用洗滌液洗5次（10min×5)甩干。加入1：500稀釋的第二抗體，混勻，37℃作用2h，洗滌同上。加入新配制的底物溶液于室溫下?lián)u動(dòng)直至出現(xiàn)紫色（或紫褐色)并看到背景（1～5min)時(shí)用蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，空氣干燥封于塑料袋中避光保存；⑤Apo（a)表型判定：量出Apo（a)蛋白帶中心距分離膠界面的距離，對(duì)照ApoB100和高分子量標(biāo)準(zhǔn)的泳動(dòng)距離，確定Apo（a)帶型及各表型的分子量范圍。在SDS-PAGE中蛋白質(zhì)的遷移速度主要取決于它的分子量大小而與其形態(tài)及所帶電荷多少無(wú)關(guān)。用巰基乙醇打開(kāi)Apo（a)與ApoB100之間的二硫鍵，Apo（a)的分子量即可通過(guò)與蛋白標(biāo)準(zhǔn)比較相對(duì)遷移率的辦法而求得。并按其與ApoB100在凝膠中遷移速率的快慢而將其分為F（較ApoB100快)，B（與ApoB100相似)，S1、S2、S3、S4（依次較ApoB100慢)6種多態(tài)異構(gòu)體并組合成各種Apo（a)表型，見(jiàn)圖19-1所示。
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圖19-1 幾種Apo（a)表型的免疫印跡分析示意圖譜
3．實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化
在此方法中，聚丙烯酰胺凝膠起著載體和分子篩的雙重作用，不同濃度的凝膠適于不同分子量的蛋白質(zhì)分離，國(guó)外用于Apo（a)表型測(cè)定的凝膠濃度差異較大（3.25%～7.5%),經(jīng)過(guò)對(duì)此實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離膠選用6.6%較為適宜，其操作方便，分離效果也較好。分離和轉(zhuǎn)移電泳都會(huì)因產(chǎn)熱而影響實(shí)驗(yàn)效果。而國(guó)產(chǎn)電泳槽冷卻裝置效果較差。為解決這一矛盾，除選用諸如Bio-Rad產(chǎn)垂直板電泳槽及轉(zhuǎn)印槽（Model 220 dualvertical-slab gel electrophoresis cell,TransblotTm cell；Bio-Rad Labs；Richmond,CA)外，可采取降低電壓延長(zhǎng)電泳時(shí)間和4℃環(huán)境中電泳的措施，也可取得較好效果，免疫印跡反應(yīng)中也可選用鼠抗人Apo（a)單克隆抗體作為一抗，用酶標(biāo)兔抗鼠IgG作為二抗。應(yīng)用酶標(biāo)抗體反應(yīng)作為二抗時(shí)，底物以脂溶性4-氯-1-萘酚或聯(lián)茴香胺較水溶性DAB溶液為好，也可用金標(biāo)、I125標(biāo)抗體作為二抗，通過(guò)銀染或放射自顯影技術(shù)顯示Apo（a)蛋白區(qū)帶，但此類方法已較少使用。將生物素標(biāo)記的抗體作為二抗，通過(guò)生物素-親和素系統(tǒng)放大信號(hào)，可大大提高檢測(cè)敏感性。血清標(biāo)記貯于4℃一周或貯存于-80℃一年內(nèi)仍可檢出Apo（a)遺傳表型。Kamboh等介紹的方法多采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量定型法確定Apo（a)異構(gòu)體。Sandholzer等報(bào)道，Apo（a)6種異構(gòu)體分子量分別為F：＜400000，S1≈520000，S2≈580000，S3≈640000，S4＞700000，國(guó)外現(xiàn)已有Apo（a)表型測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物（含異構(gòu)體F、S1～S3-Impayment-defi.com/sanji/munoAG、Austria)，可用于Apo（a)異構(gòu)體判定及質(zhì)控。分子量標(biāo)準(zhǔn)除采用凝膠染色外，也可將分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白轉(zhuǎn)移電泳至NC膜上，切下非特異性轉(zhuǎn)移帶（即標(biāo)準(zhǔn)部分)用低濃度CBBG-250或氨基黑10B染色法染色，并記下標(biāo)準(zhǔn)的位置。
臨床上對(duì)Apo（a)多態(tài)性研究是從80年代開(kāi)始的。近十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)分析不同Apo（a)多態(tài)在不同種族正常人、冠心病、高脂血癥、腦血管病、糖尿病等人群中的分布，以及對(duì)高脂血癥家系調(diào)查，得出下述一些結(jié)論：
1．Apo（a)表型payment-defi.com/zhicheng/對(duì)于每個(gè)研究個(gè)體來(lái)說(shuō)是終生固定的，不因身體狀況而改變。Apo（a)表型受遺傳基因控制，其遺傳遵循孟德?tīng)栠z傳規(guī)則，即個(gè)體中出現(xiàn)的Apo（a)多態(tài)總存在其雙親中。
2．Apo（a)表型以一種異構(gòu)體構(gòu)成的單一表型為多（以S4較多見(jiàn))；最多由兩種Apo（a)異構(gòu)體構(gòu)成同一血清表型，此類雙表型以S2/S3為多見(jiàn)，正常人群中較常見(jiàn)的Apo（a)表型為S4、S3、S2、B、S1少見(jiàn)；F罕見(jiàn)。亞洲人群S4較歐美人群頻率明顯增高，說(shuō)明Apo（a)多態(tài)性可能存在一定種族差異性。
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圖19-2 Apo（a)異構(gòu)體分子量，人群中出現(xiàn)頻率和血清Lp（a)水平
3．Apo（a)異構(gòu)體分子量與其血清Lp（a)濃度呈負(fù)相關(guān)。即高分子量Apo（a)表型伴低Lp（a)濃度，低分子量Apo（a)表型伴高Lp（a)濃度，見(jiàn)圖19-2所示。
4．冠心病(CHD)患者與正常人Apo（a)表型頻率分布具有顯著性差異，雙表型頻率明顯高于正常人,伴高Lp(a)水平的Apo（a)表型B、S1和S2頻率也顯著高于正常人。同種表型者，冠心病組血清Lp(a)水平多高于正常對(duì)照組。國(guó)內(nèi)秦樹(shù)存等研究認(rèn)為，Apo（a)低分子量表型（B、S1、S2)與高水平的Lp（a)密切相關(guān)，為我國(guó)漢族人群中CHD的獨(dú)立的遺傳危險(xiǎn)因素。莊一義等研究發(fā)現(xiàn)Apo（a)研究表型在心腦血管疾�。–CVD)患者與正常對(duì)照組之間的分布存在明顯差異，伴高水平Lp（a)的表型B、S1在CCVD組中出現(xiàn)的頻率（19%)高于對(duì)照組（5.7%)；相反，伴低水平Lp（a)表型S4和未檢出（null)在CCVD組中出現(xiàn)頻率（36.2%),低于對(duì)照組(51.9%)。
5．研究證明，Ⅲ型高脂血癥（HLP)、周圍血管性疾�。≒VD)、晚期腎�。‥SRD)、糖尿病等患者Apo（a)表型頻率分布與正常人均無(wú)顯著性差異，但血清Lp（a)濃度顯著高于正常人。一般高分子量表型（S2、S3、S4)患者血清Lp（a)水平高于同表型正常人。這些資料顯示，除Apo（a)基因多態(tài)性明顯影響血清Lp（a)水平外，一些非遺傳因素（如環(huán)境、性激素水平等)和/或其他遺傳因素對(duì)Lp（a)水平也有影響。
