動脈粥樣硬化:第四節(jié)　載脂蛋白E

一、ApoE的蛋白結(jié)構(gòu)

載脂蛋白E是一種富含精氨酸的堿性蛋白，人ApoE299個氨基酸殘基組成，分子量為34145D，含32個Arg和12個Lys存在于血漿的CM、VLDL及其殘粒和β-VLDL中均含有ApoE，一部分ApoE在血液中與ApoAⅡ形成復(fù)合體。

Shore于1973年首先發(fā)現(xiàn)ApoE，Rall等于1982年測出ApoE的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，其后Taylor建立ApoE的cDNA序列，Breslow 和Zannis首先測出ApoE有3個等位基因異構(gòu)體以及基因在染色體上的定位。據(jù)推算和測定，在介質(zhì)中ApoE有62%的α-螺旋，9%的β-片層，11%的β-轉(zhuǎn)角和18%無規(guī)則線團。ApoE分子可以被凝血酶水解為二個區(qū)域，N-端區(qū)（1～191)為22kD的可溶性球蛋白，此區(qū)域較穩(wěn)定，該片段的136～158位肽段為受體結(jié)合位點，富含堿性氨基酸（賴氨酸和精氨酸)，也屬于肝素結(jié)合區(qū)。此片段為一個反平行的四螺旋束，是α-螺旋蛋白的一般折疊方式。C端區(qū)（216～299)分子量為10kD，螺旋程度很高，不穩(wěn)定，是與脂蛋白的結(jié)合區(qū)。用截去了末端的變異體及合成多肽片段進行ApoE羧基末端的檢測表明，191殘基以外羧基端存在三個螺旋，其中兩個為A型（203～223和225～266)，第三個（268～289)為一種G型螺旋。與脂類或不同的脂質(zhì)微粒或二甲基磷脂酰膽堿結(jié)合的結(jié)果說明，G螺旋和第二螺旋的末端在脂質(zhì)連結(jié)，在ApoE的四聚體化過程中起重要的作用。更精確地說是263～286片段可能在脂連結(jié)ApoE與VLDL的結(jié)合中起有關(guān)鍵作用。ApoE主要由肝臟合成，近年來發(fā)現(xiàn)腦，腎，骨骼，腎上腺及巨噬細胞也能合成。ApoE其結(jié)構(gòu)如圖3-2所示。

圖3-2 載脂蛋白E結(jié)構(gòu)示意圖

二、ApoE的生理功能

ApoE生理功能有：①是LDL受體的配體，也是肝細胞CM殘粒受體的配體，它與脂蛋白代謝有密切相關(guān)性；②ApoE具有多態(tài)性，多態(tài)性是決定個體血脂水平與動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；③參與激活水解脂肪的酶類，參與免疫調(diào)節(jié)及神經(jīng)組織的再生。

人類ApoE主要在肝臟和腦組織合成，在其他組織包括單核細胞（含巨噬細胞)也有合成能力。人的腎上腺、卵巢顆粒細胞也能合成ApoE。腦中ApoE的mRNA表達總量是肝臟的1/3，星形細胞是其主要合成部位。腦中生成的ApoE的作用可能是使細胞內(nèi)的脂類重新分配而保持腦環(huán)境中的膽固醇平衡。腦腫瘤中發(fā)現(xiàn)有高濃度的ApoE，推斷它可能作為神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤的標(biāo)記。

三、ApoE多態(tài)性

Utermann等于1975年首先觀察到ApoE多態(tài)性，利用等電聚焦電泳和SDS-PAGE可以確認(rèn)ApoE的多態(tài)性，其后又被直接檢測的cDNA序列所證實。ApoE有三種構(gòu)體（isoform)即E₂、E₃和E₄。有的人只含有一種主要異構(gòu)體，即為純合子；www.med126.com有人可含兩種主要異構(gòu)體，即為雜合子。由此可見，人群中可有六種不同的表型（phenotype)。

各種生物都能通過生殖產(chǎn)生子代，子代和親代之間，無論在形態(tài)構(gòu)造或生理機能的特點上都很相似，這種現(xiàn)象稱為遺傳（heredity)，但是，親代和子代之間，子代的各個體之間不會完全相同，總會有所差異，這種現(xiàn)象叫變異（variation)。遺傳和變異是生命的特征。遺傳和變異的現(xiàn)象是多樣而復(fù)雜的，正因為如此，才導(dǎo)致生物界的多種多樣性，生物體所具有的遺傳性狀稱為表型或表現(xiàn)型（phenotype)，生物所具有的特異基因成分稱為基因型（genotype)。表型是基因型與環(huán)境因素相互作用的結(jié)果。遺傳物質(zhì)是相對穩(wěn)定的，但又是可變的，遺傳物質(zhì)的變化以及由其所引起表型的改變，稱為突變（mutation)。遺傳物質(zhì)的突變包括染色體畸變和基因突變。基因突變是染色體中某一點上發(fā)生化學(xué)改變，所以又稱為點突變（point mutation)�；�因結(jié)構(gòu)和遺傳表型的研究是深入了解脂蛋白代謝缺陷癥的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，逆向遺傳學(xué)方法（reversegenetic approach)則使其有可能在蛋白質(zhì)水平系統(tǒng)地分析結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系�，F(xiàn)已采用一個特定的cDNA探針從基因庫中篩選所需要的基因進行cDNA克隆，測定其核苷酸序列，然后從核苷酸序列推斷蛋白質(zhì)氨基酸序列。目前已分離出許多與動脈粥樣硬化有關(guān)的脂蛋白的cDNA克隆，并將其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的氨基酸排列順序和基因的核苷酸順序測出�，F(xiàn)已查明，ApoAⅠ,ApoⅣ,ApoE, ApoB, ApoCⅡ和Apo（a)都存在著異構(gòu)體，也就是說存在著各種不同的表型或基因型，并可分別從蛋白質(zhì)水平和核酸水平進行分型。

Zannis于1981年根據(jù)ApoE表型提出ApoE基因模型，認(rèn)為ApoE的合成是由位于一個基因位點上的三個等位基因所控制，即E₂、E₃和E₄，每一個等位基因?qū)��?yīng)于一個主要異構(gòu)體產(chǎn)生三種純合子（E2/2，E3/3，E4/4)和三種雜合子（E2/3，E2/4，E3/4)共六種常見表型，另外還有極少見的異構(gòu)體。一般認(rèn)為，次要異構(gòu)體是由主要異構(gòu)體翻譯后，經(jīng)唾液酸糖化修飾后轉(zhuǎn)變而來。ApoE3/3型又稱野生型。ApoE的氨基酸序列的112位和158位兩種氨基酸殘基即精氨酸（Arg)和半胱氨酸（Cys)的交換決定了異構(gòu)體的種類。ApoE4在這兩個位置上都是Arg；E₂都是Cys；112位為Cys和158位是Arg者為ApoE3異構(gòu)體，見圖3-3所示，自然人群中，基因頻率ε3分布最高，ApoE3/3表型分布約70%。

圖3-3 人ApoE三種主要異構(gòu)體的氨基酸殘基及基因密碼的改變位置

由于ApoE多態(tài)性具有生物學(xué)重要性，對ApoE多態(tài)性的研究是目前醫(yī)學(xué)的熱門話題。ApoE表型和基因型的檢測方法很多，多年來先后采用等電聚焦電泳和基因分析術(shù)進行檢測。目前從基因水平研究ApoE基因型顯然優(yōu)于其蛋白表型，因為ApoE翻譯后修飾會影響蛋白分析，常見ApoE的蛋白表型和基因型圖譜如圖3-4、圖3-5所示。

圖3－4　等電聚焦檢測的ApoE表型

圖3-5 ApoE基因PCR產(chǎn)物HhaⅠ酶切后RFLP圖譜

M：PBr 322 DNA/Hhe Ⅲ Markers;1-5；分別為ε4/4、ε4/2、ε4/3和3/3；基因型6：PCR產(chǎn)物（292bp)

四、ApoE多態(tài)性與疾病

人群中ApoE多態(tài)性存在種族變異，不同人群中ApoE基因型高度不同。歐洲人ε4等位基因頻率從北到南呈下降趨勢的分布。亞洲人ε4頻率低，相比之下，非洲人及巴布比亞和新幾內(nèi)亞ε4頻率高。

由于早期觀察到ApoE2/2表型的Ⅲ型高脂蛋白血癥病人未在成年即患冠心病，從此，對ApoE多態(tài)性進行了廣泛研究，許多證據(jù)認(rèn)為，ApoE多態(tài)性是動脈粥樣硬化早期及發(fā)展過程中個體差異的主要原因。大量人群調(diào)查發(fā)現(xiàn)ε4等位基因的一般作用是可以顯著地升高健康人的總膽固醇濃度，使之易患動脈粥樣硬化，相反，ε2等位基因的一般作用是降低膽固醇濃度，其降低效應(yīng)是ε4升高膽固醇的2～3倍。ApoE等位基因變異還與血漿ApoB濃度、甘油三酯及血管收縮壓有關(guān)。Menzel等認(rèn)為ε2等位基因?qū)�冠狀動脈硬化的發(fā)展有防護作用，經(jīng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，患心血管疾病如心肌梗塞幸存者，或血管造影證明有動脈粥樣硬化者，比其對照組的ε4等位基因頻率高。ApoE4/3雜合子比E3/2和E3/3基因型者發(fā)生心肌梗塞年齡早。ApoE多態(tài)性變異還與腎病綜合癥、糖尿病有關(guān)。

值得重視的是ApoE多態(tài)性與老年性癡呆病（AD)的關(guān)系。1993年，Rose研究發(fā)現(xiàn)，晚發(fā)性家族型AD病人ε4頻率增多，還發(fā)現(xiàn)ApoE和來源于淀粉樣前體蛋白的小多肽Aβ的親和力很高。其后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)AD病人中攜帶ε4等位基因者占46.2%，而對照組占13.2%。還發(fā)現(xiàn)攜帶二個ε4等位基因的研究對象比攜帶一個ε4的研究對象發(fā)生AD年齡早，比不攜帶ε4等位基因的研究對象發(fā)生AD年齡更早，1994年，Schacher等人相繼報道百歲老人普遍攜帶ε2基因。。這一發(fā)現(xiàn)使ApoE多態(tài)性和研究向前邁出了一大步。有報道高老年人攜帶ε2等位基因數(shù)量是年青人的2倍。因此ε2等位基因似乎不僅可以保護人們免患AD，而且還與長壽有關(guān)。ApoE多態(tài)性與AD的關(guān)系，目前的研究主要集中在腦代謝中與Aβ或Tau蛋白以及神經(jīng)元生長和分枝等有關(guān)。

總之，在研究高脂血癥評定心腦血管疾病的危險因素方面，以ApoE多態(tài)性為手段進行研究有重要的臨床意義。有學(xué)者認(rèn)為，基因型的“壞”（ε4)和“好”（ε2)的等位基因之間的平衡，可作為基因分析應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，協(xié)助臨床疾病的診斷。