當(dāng)光線通過一個(gè)渾濁介質(zhì)溶液時(shí),由于溶液中存在混濁顆粒,光線被吸收一部分,吸收的多少與混濁顆粒的量成正比,這種測(cè)定光吸收量的方法稱為透射比濁法。這一方法早于1959年Schultre和Schuick等報(bào)道應(yīng)用于血漿蛋白與其抗體結(jié)合后形成復(fù)合物,導(dǎo)致濁度的改變,再進(jìn)行透射比濁測(cè)定,一般采用抗體對(duì)抗原定量的透射比濁法,稱為免疫透射比濁法。其原理是,利用抗原和抗體的特異性結(jié)合形成復(fù)合物,通過測(cè)定復(fù)合物形成量的多少對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定量的方法。在介質(zhì)溶液中,抗原與特異性抗體在一定條件下才能形成復(fù)合物,一定的條件包括:①對(duì)抗體的要求,作為體液或組織中蛋白質(zhì)種類很多,若要快速特異檢測(cè),要求有單價(jià)特異抗體才能與抗原形成復(fù)合物。某一種蛋白質(zhì),有其特異抗體才能與該抗原結(jié)合,形成免疫復(fù)合物進(jìn)行定量,若抗體不純混雜有另一種或兩種少量的抗體,這種免疫復(fù)合物就不是單一復(fù)合物而是大雜燴,結(jié)果偏高;②抗原抗體比例適當(dāng),因免疫復(fù)合物形成有三個(gè)階段,第一階段是復(fù)合物形成抗原抗體復(fù)合物;第二階段是初步形成抗原抗體復(fù)合物,此階段是復(fù)合物交聯(lián)成大的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu);第三階段是復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀。只有在抗原與抗體等價(jià)時(shí)即無過?贵w,此時(shí),復(fù)合物的結(jié)合與解離處于平衡狀態(tài),其混濁程度達(dá)高峰。在抗體過量時(shí),隨抗原量的增加而復(fù)合物形成也增加,其測(cè)定只能在反應(yīng)曲線的左側(cè)進(jìn)行(見圖18-4);③一般要求溶液中有非離子性親水多聚體促進(jìn)免疫復(fù)合物的形成,如聚二乙醇6000等。溶液pH為6.5~8.0之間為宜。載脂蛋白有形成兩性螺旋片(amphipathic helix)的特性,對(duì)脂質(zhì)(特別是磷脂)有高度親和力,與脂質(zhì)結(jié)合后有時(shí)會(huì)掩蓋抗原位點(diǎn)或構(gòu)象改變,可以部分或完全喪失對(duì)抗血清的特異反應(yīng)。為此,載脂蛋白檢測(cè)過程中有必要先暴露抗原位點(diǎn),所用試劑有表面活性劑,尿素,鹽酸胍和吐溫等解離蛋白劑,或用四甲基脲脫脂或有機(jī)溶劑脫脂等暴露抗原決定簇等方法,血清脂蛋白顆粒中的載脂蛋白,能在短時(shí)間內(nèi)形成抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行定量;④抗原不能過量,因?yàn)榭乖^量,抗原抗體復(fù)合物形成不但不增加,反而會(huì)減少,光散射或光吸收減少,檢測(cè)結(jié)果反而偏低。
圖18-4 抗原抗體反應(yīng)曲線
在免疫比濁過程中,由于抗原抗體結(jié)合的三過程,從而導(dǎo)致光密度與濃度之間不呈線性關(guān)系,一般是3次方程曲線關(guān)系。若將抗原與抗體兩個(gè)變量之間的變動(dòng)特征恰當(dāng)?shù)胤从吵鰜,需要?jīng)過3次方程擬合成近似直線化的曲線方程,再進(jìn)行運(yùn)算,免疫比濁中,采用終點(diǎn)法或速率法,用5個(gè)或7個(gè)不同梯度進(jìn)行定標(biāo),經(jīng)3次曲線方程求出一條能反映真實(shí)情況的濃度與光密度的關(guān)系曲線方程,才能作為定量的工作曲線。
脂蛋白抗原在溶液中與相應(yīng)特異抗體形成抗原抗體復(fù)合物的混濁顆粒,分散于溶液介質(zhì)中,在一定波長(zhǎng)下測(cè)定其混濁程度,進(jìn)行ApoAⅠ(B100)的定量測(cè)定。
(一)手工操作
1.原理
血清ApoAⅠ(B100)+抗人ApoAⅠ(B100)→抗原抗體復(fù)合物→測(cè)定光密度
2.試劑(伊利康)
(1)Apo緩沖液(RⅠ),含4%PEG6000和表面活性劑
www.med126.com(2)羊抗人ApoAⅠ(B100)抗體液(RⅡ):監(jiān)用前取抗血清200μl,加0.9%NaCl液700μl,混勻,待用,置冰箱一周內(nèi)有效。
(3)ApoAⅠ(B100)參考血清(RⅢ)
3.操作
(1)按ApoAⅠ抗血清液或ApoB100抗血清100μl,加相應(yīng)的Apo緩沖液0.9ml的比例混合成單一試劑(Apo抗體液)。最好臨用前配制當(dāng)天用量。
(2)各試劑用量如下表
ApoAⅠ | ApoB100 | |||||
標(biāo)準(zhǔn)管 | 測(cè)定管 | 空白管 | 標(biāo)準(zhǔn)管 | 測(cè)定管 | 空白管 | |
參考血清 | 5μl | 5μl | ||||
待測(cè)血清 | 5μl | 5μl | ||||
ApoAⅠ抗體液 | 1.0ml | 1.0ml | 1.0ml | |||
ApoB100抗體液 | 1.0ml | 1.0ml | 1.0ml |
混勻各管,37℃保溫10min,波長(zhǎng)340min,于半自動(dòng)分析儀上先www.med126.com吸入空白管液,再吸入標(biāo)準(zhǔn)管,儀器根據(jù)光密度及參考值得出一換算系數(shù),再吸入測(cè)定管,儀器內(nèi)根據(jù)光密度及系數(shù)進(jìn)行運(yùn)算,打印結(jié)果。
(3)定標(biāo)方法,根據(jù)免疫比濁法原理,應(yīng)取多點(diǎn)(3~9點(diǎn)),按y=a+bx+cx2+dx3的3次方程回歸曲線進(jìn)行定標(biāo),制作參考工作曲線。
①校正工作曲線的繪制:
配制抗血清稀釋工作液:按RⅠ試劑0.9ml,加RⅡ試劑100μl的比例(Apo抗體液)混勻,待用。
制備5點(diǎn)校正液:取RⅢ(參考血清),用0.9%生理鹽水倍比稀釋成5個(gè)濃度,第5管為原參考血清濃度,其他4管分別為第5管的1/2、1/4、1/8、1/16(或濃度為0即0.9%NaCl)。
表18-20 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的各管(點(diǎn))濃度
管號(hào) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
1號(hào)管(0)(μl) | 5 | ||||
2號(hào)管(1/8)(μl) | 5 | ||||
3號(hào)管(1/4)(μl) | 5 | ||||
4號(hào)管(1/2)(μl) | 5 | ||||
5號(hào)管(1/1)(μl) | 5 | ||||
Apo抗體液(ml) | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
混勻各管,置37℃水浴保溫10min,按程序上機(jī)作工作曲線。
②標(biāo)本測(cè)定:吸待測(cè)血清(測(cè)定管)5μl,加上述稀釋抗血清工作液1.0ml,于37℃水浴保溫10min,上機(jī)讀數(shù),打印結(jié)果。
③如測(cè)定值超過工作曲線上限值,儀器會(huì)打印顯示“過高”,此時(shí),將待測(cè)標(biāo)本稀釋1倍再測(cè)。
④每批號(hào)的抗血清應(yīng)作一次多點(diǎn)定標(biāo),即測(cè)定標(biāo)本的抗血清應(yīng)與定標(biāo)的抗血清是同一批號(hào)抗血清。
(二)生化分析儀測(cè)定
1.原理
脂蛋白抗原在溶液中與相應(yīng)特異抗體形成抗原抗體復(fù)合物的混濁顆粒分散于溶液介質(zhì)中,在一定波長(zhǎng)下測(cè)定其混濁程度,進(jìn)行ApoAⅠ(B100)的定量測(cè)定。
ApoAⅠ(B100)+抗人ApoAⅠ(B100)→抗原抗體復(fù)合物→測(cè)定吸光光密度
2.雙試劑單(雙)波長(zhǎng)法
(1)試劑(溫州伊利康)
RⅠ:Apo緩沖液,含4% PEG6000和表面活性。
RⅡ:羊抗人ApoA(B100)稀釋抗血清
RⅢ:Apo定值血清
(2)各試劑及標(biāo)本用量如下表:
項(xiàng)目 | 血清 | Apo緩沖液 (RⅠ) | ApoAⅠ抗血清液 (RⅡ) | ApoB100抗血清液 (RⅡ) |
ApoAⅠ | 2~5μl | 300~350μl | 80~100μl | |
ApoB100 | 2~5μl | 300~350μl | 80-100μl |
(3)定標(biāo):以5點(diǎn)Apo梯度濃度,采用免疫定標(biāo)法按表18-21參數(shù)上機(jī)定標(biāo),如圖18-5所示。
圖18-5 ApoAⅠ 五點(diǎn)免疫定標(biāo)曲線圖(以CL-7200儀器為例)
(4)上機(jī)(終點(diǎn)法或兩點(diǎn)法)
(5)說明:①Apo測(cè)定的光密度從340~700nm范圍都可采用,多用340nm;②國(guó)內(nèi)已有的Apo試劑盒均無需處理;③血清標(biāo)本也無需處理,均可直接檢測(cè);④本法適用于多種類型的全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè),自動(dòng)扣除空白,快速準(zhǔn)確;⑤效價(jià)不同的抗血清,其用量應(yīng)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
(5)計(jì)算△A=A2-A1,以△A值采用免疫定標(biāo)自動(dòng)運(yùn)算。
3.單一試劑單波長(zhǎng)法
(1)試劑同雙試劑法
(2)標(biāo)本及試劑用量:按ApoAⅠ抗血清液或ApoB抗血清液(RⅡ)100μl,加相應(yīng)的Apo緩沖液(RⅠ)0.3ml的比例混合成單一試劑(Apo抗體液)。最好臨用前配制當(dāng)天用量,此抗體液置2~8℃保存一周有效。
(3)定標(biāo):按五點(diǎn)梯度稀釋定值血清(見表18-21),以終點(diǎn)法或兩點(diǎn)法進(jìn)行免疫定標(biāo)。
(4)按以下步驟操作:
(5)以△A=A2-A1值按免疫定標(biāo)自動(dòng)運(yùn)算。
(6)說明:①該法一般用半自動(dòng)生化分析儀;②通過設(shè)延遲時(shí)間以扣除空白;③RⅠ、RⅡ試劑以臨用時(shí)混合為好,未用完的混合試劑應(yīng)置于2~8℃冰箱保存,只允許使用一周;④血清標(biāo)本無需再處理。
4.ApoAⅠ、AⅡ、B、CⅡ、CⅢ和E的全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)的有關(guān)數(shù)據(jù)。
(1)上機(jī)參數(shù)(以CL-7200型為例)如表18-21所示。
表18-21 自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)Apo有關(guān)參數(shù)
ApoAⅠ | AⅡ | B | CⅡ | CⅢ | E | |
反應(yīng)類型 | 終 點(diǎn)法 | |||||
樣品量 | 3μl | 3μl | 3μl | 8μl | 3μl | 5μl |
測(cè)量波長(zhǎng) | 600nm(第一) | 數(shù)據(jù) | 數(shù)據(jù) | 700nm | 700nm | 700nm |
700nm(第二) | 數(shù)據(jù) | 數(shù)據(jù) | 340nm | 340nm | 340nm | |
反應(yīng)時(shí)間 | 第一波長(zhǎng)5min | 數(shù)據(jù) | 數(shù)據(jù) | 數(shù)據(jù) | 數(shù)據(jù) | 數(shù)據(jù) |
第二波長(zhǎng)4.99min | 數(shù)據(jù) | 數(shù)據(jù) | 數(shù)據(jù) | 數(shù)據(jù) | 數(shù)據(jù) | |
試劑Ⅰ | 350μl | 290μl | 350μl | 300μl | 290μl | 350μl |
試劑Ⅱ | 100μl | 75μl | 100μl | 50μl | 75μl | 50μl |
單位 | g/L | g/L | g/L | mg/dl | mg/dl | mg/dl |
標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)數(shù) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備參數(shù)如表18-22所示。
表18-22 生化分析儀檢測(cè)Apo的定標(biāo)濃度
標(biāo)準(zhǔn)管號(hào) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
稀釋倍數(shù) | 0 | 1:2 | 1:4 | 1:8 | 1:16 | 0 |
ApoAⅠ度數(shù)(g/L) | 172 | 86 | 43 | 21.5 | 10.8 | 0 |
ApoAⅡ度數(shù)(g/L) | 36 | 18 | 9 | 4.5 | 2.25 | 0 |
ApoB濃度(g/L) | 180 | 91 | 45.5 | 22.6 | 11.3 | 0 |
ApoCⅡ濃度(mg/dl) | 4 | 2 | 1 | 0.5 | 0.25 | 0 |
ApoCⅢ濃度(mg/dl) | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.63 | 0.31 | 0 |
ApoE濃度(mg/dl) | 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.625 | 0 |
5.單一試劑和雙試劑檢測(cè)方法的比較
單一試劑和雙試劑在全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定的光密度變化過程,如圖18-6所示。
從理論上考慮任何一種生化測(cè)定方法的試劑,臨用時(shí)混合最好,可以消除試劑各種成份的自身化學(xué)變化和相互影響。而在實(shí)際工作中,是不可能的,只能是將幾種不會(huì)起化學(xué)反應(yīng)而又無相互影響的試劑配制成2~4種,臨用時(shí)按一定比例配制使用。臨床化學(xué)試劑盒,目前主要以1或2種試劑形式供醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)使用,即單一試劑和雙試劑兩種形式。
筆者認(rèn)為雙試劑比單一試劑好,尤其是含酶試劑和免疫試劑以雙試劑包裝形式為好,有利于對(duì)酶的活性或抗體效價(jià)的保存。單一試劑是所有試劑混合在一起,存放過程中,有可能因化學(xué)物質(zhì)的存在而損害試劑中的工具酶或抗體,存放時(shí)間越長(zhǎng),損害可能性越大,然而雙試劑不存在這一問題。
對(duì)脂質(zhì)的測(cè)定雙試劑法更顯其優(yōu)越性,因?yàn)檠逯兄|(zhì)與載脂蛋白是以脂蛋白的形式存在,當(dāng)測(cè)定試劑與血清標(biāo)本混合后,首先解聯(lián)脂蛋白,讓其釋放出脂質(zhì)和載脂蛋白,。作為免疫測(cè)定試劑還兼有使載脂蛋白抗原決定簇暴露的作用。當(dāng)R1試劑作用完后,加進(jìn)第二試劑(R2)后,使其抗體適應(yīng)抗原決定簇的要求,達(dá)到抗原抗體結(jié)構(gòu)呈完全的互補(bǔ)狀態(tài),從而產(chǎn)生最大的抗原抗體結(jié)合量,達(dá)到定量的目的。雙試劑測(cè)定法,既能自動(dòng)扣去空白,又能使化學(xué)反應(yīng)快速進(jìn)行,從而迅速地完成檢測(cè)的全過程。
圖18-6 單雙試劑法反應(yīng)過程的光密度變化曲線圖
A:雙試管法;B:為單一試劑法
(賀小玲 胡漢寧)