現(xiàn)代醫(yī)學(xué)是隨著自然科學(xué)各基礎(chǔ)學(xué)科的發(fā)展而發(fā)展。在臨床觀察的基礎(chǔ)上,其檢驗、診斷、治療和病理生理學(xué)的進展是與實驗研究方法的創(chuàng)新與改進分不開的。分子生物學(xué)的迅速發(fā)展,全面地滲透到醫(yī)學(xué)科學(xué)各個領(lǐng)域中,揭示了許多新現(xiàn)象,提出了不少新問題,是醫(yī)學(xué)向分子水平邁進的一個重要依據(jù)和手段。使醫(yī)學(xué)科學(xué)達(dá)到了一個新的階段,醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)已逐漸形成了比較完整的理論體系。醫(yī)學(xué)檢驗與診斷學(xué)也不例外,分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗診斷中的廣泛應(yīng)用,逐步形成診斷分子生物學(xué)(diagnostic molecular biology)這一學(xué)科分支。診斷分子生物學(xué)的內(nèi)容主要包括:
⒈內(nèi)源基因異常的檢驗與診斷 在分子水平為疾病的發(fā)生機制,治療和預(yù)后提供實驗依據(jù)。自身基因結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致基因功能異常而致病,或使其表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能異常而致病,或使基因調(diào)控失常而致病,如遺傳性疾病、腫瘤等。
⒉外源基因侵入體內(nèi)的檢驗與診斷 對多種病源微生物(如細(xì)菌、病毒、衣原體、支原體等)的檢出,可望實現(xiàn)快速、靈敏、準(zhǔn)確。在分子水平可更準(zhǔn)確地分類亞種和變種。探明病源微生物致病的機制。
生物大分子指核酸和蛋白質(zhì)分子,是生命物質(zhì)的基本要素,如最簡單的生命體病毒、噬菌體僅以核酸,蛋白質(zhì)為主,卻表現(xiàn)了生命的最基本的功能。核酸的表達(dá)產(chǎn)物是蛋白質(zhì),為因果關(guān)系。核酸是生命的存在形式,蛋白質(zhì)是生命的表現(xiàn)形式。許多疾病的臨床表現(xiàn)與某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能異常有關(guān),但究其原因可能是基因的結(jié)構(gòu)和功能異常導(dǎo)致基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)異常所為。
蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的檢驗和臨床診斷應(yīng)用方法已日趨完善,而核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究歷史短,研究前景廣,是目前分子生物學(xué)研究的主要內(nèi)容。特別是在臨床檢驗、診斷、預(yù)后、治療方面的開發(fā)前景受到醫(yī)學(xué)工作者關(guān)注。
核酸(nucleicacid)具有儲存和表達(dá)遺傳信息的功能,前者為脫氧核糖核酸(deoxyri-bonucleic acid,DNA)承擔(dān),后者由核糖核酸(ribonucleic acid,RAN)參與。堿基(base)、脫氧核糖(deoxyribose)或核糖(ribose)、磷酸(phosphate)三種分子組成核苷酸(nucleotide),核苷酸之間以磷酸二酯鍵在縱向按一定的排列順序組成核酸的一級結(jié)構(gòu),是鏈狀結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上形成二級或更高級的空間結(jié)構(gòu),方能顯示其生物功能。
組成DNA的堿基有腺嘌呤(adenine A)、鳥嘌呤(guanine G)、胞嘧啶(cytosine C)和胸腺嘧啶(thymine T),RNA的堿基為A、G、C和尿嘧啶(uracil U)。堿基在紫外光260nm波長附近有較強吸收峰,該特性常用于核酸分析。堿基(嘌呤環(huán)的N-9或嘧啶環(huán)的N-1)與核糖(C-1′)以糖苷鍵結(jié)合形成核苷,核苷(C-5′)與磷酸以磷酸酯鍵結(jié)合形成核苷酸。核苷可與1-3個磷酸結(jié)合,如腺苷與一個磷酸結(jié)合為腺苷酸(AMP),與二個磷酸結(jié)合為二磷酸腺苷(ADP),與三個磷酸結(jié)合為三磷酸腺苷(ATP)。第一個核苷酸的C-3′位羥基與第二個核苷酸的C-5′位磷酸以磷酸二酯鍵結(jié)合,以此類推成百上萬的核苷酸結(jié)合可形成一條大分子核酸單鏈,單鏈之間的堿基再以氫鍵結(jié)合可形成較穩(wěn)定的核酸大分子雙鏈結(jié)構(gòu)(二級結(jié)構(gòu))。
核酸的簡寫方式為5′AGCTGTAC3′,此外的英語字母已不代表堿基,而是指核苷酸。核酸的書寫方向與合成方向一致,都是5′→3′。習(xí)慣上堿基原子次序不用‘′’而核糖環(huán)原子標(biāo)以‘′’,故5′表示核糖的C-5,并與磷酸基團連接,3′為核糖的C-3,并帶有-OH基團?蓪懽5′pAGCTGTAC-OH3′。
核酸的高級結(jié)構(gòu)以1953年Watson和Crick發(fā)表的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)最著名。DNA分子由兩條核苷酸組成的單鏈,按右手螺旋盤旋,兩條單鏈走向相反。兩條單鏈之間的橫向堿基A=T以二個氫鍵配對,G≡C以三個氫鍵配對,使DNA分子的雙鏈之間有嚴(yán)格準(zhǔn)確的堿基配對關(guān)系payment-defi.com/hushi/,形成DNA二級結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上可形成超螺旋,即三級結(jié)構(gòu)。
DNA分子的一個重要物理性質(zhì)是在過酸、過堿或加熱的溶液中,雙鏈間的氫鍵可分開成單鏈,稱為變性。變性是可逆的,改變條件,解開的單鏈可重新按堿基配對規(guī)則,A=T、G≡C嚴(yán)格配對形成雙鏈,形成的雙鏈與變性前的結(jié)構(gòu)完全相同,稱為復(fù)性。解鏈的DNA溶液在260nm處吸光值A(chǔ)260增大,即核苷酸>單鏈DNA>雙鏈DNA,稱為高色效應(yīng),反之為低色效應(yīng)。以50μg/ml為例,A260分別為:雙鏈DNA=1.00,單鏈DNA=1.34自由堿基=1.60;或A260=1.00時雙鏈DNA=50μg/ml,單鏈DNA=37μg/ml,mRNA=40μg/ml。一般同時在A280測定蛋白質(zhì)含量,純化的DNa A260/A280≥1.8;純化的mRNaA260/A280≥2.0,即蛋白質(zhì)含量少。實驗室常用加熱使DNA變性,因為G≡C之間有三個氫鍵,而A=T之間只有二個氫鍵,解鏈溫度取決于DNA分子中G≡C配對多少。以加熱溫度對A260作圖可以得到一條解鏈曲線,解鏈開始到完全解鏈的溫度范圍的中點溫度稱為解鏈溫度(meltingtemperature,Tm)又稱熔鏈溫度。Tm值大小與DNA的G+C含量百分?jǐn)?shù)成正比。雖有推算Tm值的經(jīng)驗公式Tm=4(G+C)+2(A+T),但只能用于20個核苷酸以下的DNA小分子。而且實驗條件可影響Tm。如三氯醋酸鈉存在使Tm變小,氯化鈉存在可使Tm升高。變性的DNA溶液經(jīng)處理后,使單鏈的堿基重新配對形成雙鏈的過程叫復(fù)性或退火。同源DNA復(fù)性叫復(fù)性DNA,不同源DNA復(fù)性的過程叫核酸雜交,形成的雙鏈叫雜化雙鏈。雜交可以發(fā)生在DNA分子之間,也可以發(fā)生在DNA與RNA分子之間,如DNA-DNA′;DNA-mRNA。影響復(fù)性的因素很多,如離子強payment-defi.com/wsj/度、溫度、DNA濃度和長度等,一般采用0.15-0.5mol/l NaCl;溫度低于Tm20-25℃,過高不利于復(fù)性,過低易發(fā)生單鏈內(nèi)堿基隨機配對或非特異性結(jié)合。復(fù)性的開始是碰撞,因此DNA濃度高時,碰撞機會多,復(fù)性速度快。
DNA的生物功能是攜帶、傳遞和表達(dá)遺傳信息。基因是DNA大分子中一段有生物功能的片段。即在自然界可表達(dá)一分子具有生物活性的肽鏈,也可攜帶和傳遞給子代表達(dá)相同的肽鏈的信息;蚪M是所有基因的集合。
DNA堿基嚴(yán)格的配對,穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)可將攜帶的遺傳信息保留在生命體內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞分裂時,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開分為兩條單鏈,暴露堿基。在DNA合成酶作用下,兩條鏈各自為模板(母鏈),按堿基配對原則合成與母鏈嚴(yán)格互補的互補鏈。子代細(xì)胞的DNA分子一條鏈來自親代,一條是按堿基配對原則合成的新鏈,這一過程為復(fù)制,這種復(fù)制的方式稱為半保留復(fù)制。半保留復(fù)制使子代與親代的DNA分子雙鏈堿基序列完全一致。遺傳信息就這樣準(zhǔn)確地傳遞給子代。復(fù)制過程以母鏈為模板,游離的脫氧三磷酸核苷為合成新鏈的原料,即dATP、dGTP、dCTP、dTTP,總稱dNTP。催化新鏈合成反應(yīng)的酶是以DNA為模板的DNA聚合酶(DNA-dependentDNA polymerase)。DNA聚合酶需要一段寡核苷酸作為引物(primer)引導(dǎo),以母鏈為模板,按堿基配對原則,將dNTP逐個由5′→3′方向合成新鏈,合成的新鏈走向5′→3′與母鏈3′→5′走向相反。1958年首先在大腸埃希菌發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶Ⅰ(polⅠ),繼而發(fā)現(xiàn)原核生物有DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。聚合酶Ⅲ主要功能是復(fù)制,聚合酶Ⅰ的主要功能是在DNA堿基配對發(fā)生錯誤或DNA損傷時起修復(fù)作用,聚合酶Ⅱ的功能尚不清楚。三種聚合酶均有從5′向3′或3′向5′逐一把核苷酸從核酸鏈上水解下來的核酸外切酶(exonuclease)作用。聚合酶Ⅰ外切酶活性最強,便于切除錯誤和修復(fù)。用枯草菌溶素(蛋白酶)水解聚合酶Ⅰ后產(chǎn)生大、小片段,其中大自然切去了3′→5′的外切酶活性,保留5′→3′方向的聚合酶和外切酶活性,稱為Klenow片段(Klenow fragment),是分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。
DNA的另一個生物功能是通過轉(zhuǎn)錄和翻譯,將遺傳信息表達(dá)為具有生物功能的產(chǎn)物-基因產(chǎn)物,如肽鏈、酶、蛋白質(zhì)等。使遺傳得到表達(dá),生命得以表現(xiàn)。
RNA有信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)和核糖體RNA(rRNA),結(jié)構(gòu)相對簡單,生物功能主要轉(zhuǎn)錄DNA的遺傳信息,翻譯DNA的遺傳信息,表達(dá)DNA的遺傳信息。
合成RNA的過程為轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄酶是依賴DNA的RNA聚合酶(DNA-dependentRNA polymerase)。轉(zhuǎn)錄與復(fù)制有相似之外,均需依賴DNA的聚合酶,都以DNA為模板;均需核苷酸作原料,都為5′向3′延長;且均遵從堿基配對原則。但也有明顯的不同之處,復(fù)制是把作為模板的DNA兩條母鏈均復(fù)制,而轉(zhuǎn)錄只轉(zhuǎn)錄DNA雙鏈中的有意義鏈;合成原料前者利用脫氧核苷酸mRNA、tRNA、rRNA三種RNA,且RNA中無胸腺嘧啶T,而以尿嘧啶U代替T,堿基配對也由A=T轉(zhuǎn)為A=U;參與復(fù)制的DNA聚合酶需引物,而用于轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶無需引物,自身有識別轉(zhuǎn)錄起點的功能。與復(fù)制不同的是轉(zhuǎn)錄只需以一條DNA鏈為模板,因此把可作為轉(zhuǎn)錄模板的一條DNA鏈稱為有意義鏈(sense strand or Watson strand),與此對應(yīng)的一條不參與轉(zhuǎn)錄的鏈稱為反意義鏈(antisense strand or Crick strand)。有意義鏈并不固定在DNA雙鏈的某一條鏈上,而是在兩條鏈上交替出現(xiàn),使轉(zhuǎn)錄也是交替進行,這一現(xiàn)象稱為不對稱轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄的重要產(chǎn)物是mRNA,因為mRNA可作為肽鏈合成的模板,指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。由此把可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生mRNA并指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一段DNA稱為結(jié)構(gòu)基因(structural gene),其余的DNA可轉(zhuǎn)錄tRNA和rRNA,還有許多起調(diào)節(jié)作用的調(diào)節(jié)基因,但有相當(dāng)一部分的DNA功能尚不清楚,既不承擔(dān)轉(zhuǎn)錄功能也無調(diào)節(jié)作用。真核生物的基因往往是一種斷裂基因(splitegene)即一個結(jié)構(gòu)基因,一條有意義鏈中的DNA堿基序列并不都能表達(dá)為蛋白質(zhì)?杀磉_(dá)為蛋白質(zhì)的區(qū)域稱編碼區(qū),反之為非編碼區(qū),編碼區(qū)與非編碼區(qū)在基因中相間排列。1978年,Gilbert把可編碼蛋白質(zhì)的DNA序列稱外顯子(exon),把非編碼稱內(nèi)含子(intron)。真核細(xì)胞剛完成轉(zhuǎn)錄的mRNA含外顯子和內(nèi)含子,稱雜化核RNA(heteroge-neous nuclear RNA,hnRNA),這種初級mRNA的分子量往往比成熟的mRNA大幾倍。hnRNA在細(xì)胞核內(nèi)經(jīng)剪接加工,切去內(nèi)含子,并在5′端加上7-甲基鳥嘌呤和三磷酸鳥苷的帽子結(jié)構(gòu)(capstructure)在3′端加上多聚脫氧腺苷酸(poly A)后,進入細(xì)胞質(zhì)為成熟的mRNA。
基因表達(dá)在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯水平及各水平表達(dá)后加工均可進行調(diào)控。目前對原核生物的轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控研究較多,較為清楚。原核生物中,功能相關(guān)的幾個結(jié)構(gòu)基因往往排列在一起,轉(zhuǎn)錄出一段較長的mRNA,稱為多順反之(polycistron),并指導(dǎo)合成(翻譯)一套功能相關(guān)的蛋白質(zhì)。這樣的一組基因及調(diào)節(jié)部分稱為操縱子(operon)。乳糖操縱子(Lac operon)就是由調(diào)控區(qū)的啟動子(promoter,p)、操縱區(qū)(operator,o)和表達(dá)β-半乳糖苷酶(Z)、β-半乳糖苷透性酶(Y)、β-半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶(a)三種功能相關(guān)酶的相關(guān)基因組成。乳糖操縱子是可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控型操縱子,在高效誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)誘導(dǎo)下,產(chǎn)生相應(yīng)的酶并作用底物5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside,x-gal)產(chǎn)生藍(lán)色,在重組基因篩選中被廣泛應(yīng)用。有名的操縱子還有可誘導(dǎo)的正調(diào)控操縱子-阿拉伯糖操縱子(Ara operon),可阻遏操縱子-色氨酸操縱子(Trp operon)?烧T導(dǎo)指關(guān)閉的基因在誘導(dǎo)劑存在下可開啟表達(dá),可阻遏指開放的基因在阻遏物存在下可關(guān)閉表達(dá)。
由轉(zhuǎn)錄把DNA上基因的信息(脫氧核苷酸序列)變?yōu)閙RNA核苷酸序列,生物體合成mRNA并把轉(zhuǎn)錄的信息(核苷酸序列)轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍踪|(zhì)的氨基酸序列的過程稱翻譯。復(fù)制、轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞核完成,翻譯在細(xì)胞質(zhì)進行。
翻譯從mRNA5′開始,向3′方向每三個堿基為一個密碼(codon),稱三聯(lián)體密碼。4種堿基可組合64種密碼,代表了20種氨基酸和翻譯的起點與終止密碼,如5′-CGUGG AUAA-3′代表精氨酸甘氨酸和終止密碼。密碼之間無標(biāo)點符號,當(dāng)多一個或少一個核苷酸時,可使密碼重排列移碼(frame shiff),由此引起的變異稱移碼突變。翻譯過程中以mRNA為模板,rRNA為場所,tRNA搬運與密碼對應(yīng)的氨基酸,自mRNA5′端開始合成多肽鏈,多肽鏈合成從氨基(N)端開始,第一個氨基酸的羧基與第二個氨基酸的氨基形成肽鍵,在羧基(C)端結(jié)束。故肽鏈合成方向是N→C。經(jīng)翻譯后加工形成有活性的蛋白質(zhì)。
1958年,Crick把復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯的基因表達(dá)(geneexpression)過程總結(jié)為分子生物學(xué)的中心法則(central dogma)。以后在病毒學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)了依賴RNA的DNA聚合酶能進行逆轉(zhuǎn)錄,即反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase,逆轉(zhuǎn)錄酶),可以RNA為模板復(fù)制DNA,由此得到的DNA稱cDNA(complementary DNA,互補DNA,反轉(zhuǎn)錄DNA)。后來還發(fā)現(xiàn)了RNA復(fù)制RNA,M13噬菌體的DNA可以單鏈存在,有時DNA還能以三鏈、四鏈體形式存在,大大豐富了中心法則。