免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn):第二節(jié)　T細(xì)胞功能的檢測

T細(xì)胞具有多種生物學(xué)功能，如直接殺傷靶細(xì)胞，輔助或抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，對(duì)特異性抗原和促有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)以及產(chǎn)生細(xì)胞因子等，據(jù)此建立了一系列的檢測方法，其中有些已用作臨床檢測細(xì)胞免疫功能的指標(biāo)。

一、T細(xì)胞增殖試驗(yàn)

本試驗(yàn)又稱T細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。T細(xì)胞在體外經(jīng)某種物質(zhì)刺激，細(xì)胞代謝和形態(tài)相繼發(fā)生變化，主要表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞表面電荷即起變化，數(shù)小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)酶活化，在24～48h細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加，從而產(chǎn)生一系列增殖的變化，如細(xì)胞變大、細(xì)胞漿擴(kuò)大、出現(xiàn)空泡、核仁明顯、染色質(zhì)疏松、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變成母細(xì)胞（圖21-2)。因此，這種淋巴細(xì)胞增殖又稱淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化（lymphoblasttransformation)。淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)既可通過形態(tài)學(xué)觀察計(jì)數(shù)，也可用³H-TdR摻入法檢測細(xì)胞內(nèi)DNA合成量的增加，據(jù)此判斷出淋巴細(xì)胞對(duì)有關(guān)刺激的反應(yīng)性與功能狀態(tài)。

圖21-2 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的形態(tài)特征

體外引起淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的刺激物種類很多，可分為非抗原性刺激物和抗原性刺激物兩類。

1．www.med126.com非抗原性刺激物如植物血凝系（phytoagglutinin，PHA)、刀豆素A（concanavalinA，ConA)、美洲商陸（pokeweedmitogen，PWM)和脂多糖（LPS)等，通稱促有絲分裂原（mitogen)。其中LPS刺激B細(xì)胞，PWM可刺激T和B兩類細(xì)胞，PHA和ConA刺激T細(xì)胞增殖。

2．抗原性刺激物如破傷風(fēng)類毒素、鏈球菌激酶、純化蛋白衍生物（purifiedproteinderivative，PPD)和白色念珠菌等。同種異型組織抗原也可作為刺激物，例如HLA，用混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)法觀察器官移植中受體細(xì)胞對(duì)供體細(xì)胞的反應(yīng)性實(shí)質(zhì)上也是一種淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。

非抗原性刺激物可使正常人外周血中的淋巴細(xì)胞引起轉(zhuǎn)化，與機(jī)體是否對(duì)某種抗原致敏無關(guān)，因此屬非特異的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化。抗原刺激物的作用只能使相應(yīng)致敏的淋巴細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，因此轉(zhuǎn)化率大大低于非特異性轉(zhuǎn)化。通常應(yīng)用最多的刺激物是PHA，特異性抗原僅使已經(jīng)相應(yīng)抗原致敏的T細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率一般約5％～30％，而且需要培養(yǎng)4～5天。雖然T細(xì)胞對(duì)特異和非特異性抗原的識(shí)別過程不同，但被激活后，誘發(fā)的分裂和增殖過程卻是相同。因此根據(jù)非特異性促有絲分裂原激活T細(xì)胞增殖反應(yīng)的程度，同樣可推測T細(xì)胞識(shí)別特異性抗原增殖反應(yīng)。目前淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)是判斷T細(xì)胞功能的一項(xiàng)常用的非特異性體外免疫學(xué)檢測指標(biāo)。

該試驗(yàn)有形態(tài)計(jì)數(shù)法和同位素計(jì)數(shù)法兩種。

（一)形態(tài)法

其原則是將外周血液或分離的單個(gè)核細(xì)胞與適量的PHA混合，置37℃培養(yǎng)72h，取培養(yǎng)細(xì)胞作涂片染色鏡檢。根據(jù)細(xì)胞的大小，核與胞漿的比例，胞漿的染色性和核結(jié)構(gòu)以及有無核仁等特征，分別計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞、過渡型母細(xì)胞和核有絲分裂相細(xì)胞以及成熟的小淋巴細(xì)胞，以前三者為轉(zhuǎn)化細(xì)胞，每份標(biāo)本計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，按下列計(jì)算轉(zhuǎn)化率：

轉(zhuǎn)化率＝轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)／（轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù)＋未轉(zhuǎn)化的淋巴細(xì)胞數(shù))×100％

在正常情況下，健康人外周血經(jīng)PHA刺激的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為60％～80％，小于50％可視為降低。形態(tài)學(xué)方法簡便易行，便于基層實(shí)驗(yàn)室推廣采用，但判讀結(jié)果受主觀因素影響較大，有些細(xì)胞形態(tài)難以確認(rèn)，因此重復(fù)性和可靠性較差。

（二)同位素法

絕大多數(shù)外周血中T細(xì)胞通常處于細(xì)胞周期的G₀期，受特異性抗原或促有www.med126.com絲分裂原激活后，從G₀期進(jìn)入G₁期，并合成蛋白質(zhì)、RNA和DNA前體物質(zhì)等，為DNA復(fù)制準(zhǔn)備物質(zhì)基礎(chǔ)，然后進(jìn)入S期，細(xì)胞合成DNA量倍增，此時(shí)若在培養(yǎng)液中加³H標(biāo)記的DNA前體(³H胸腺嘧啶苷，³H-TdR)，后者即摻入新合成的DNA中，根據(jù)摻入的多少推測細(xì)胞增殖程度。檢測原則是將全血或分離的單個(gè)核細(xì)胞懸液加入含培養(yǎng)液的試管中，每份樣品分實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管，實(shí)驗(yàn)管加最適量和亞適量PHA后，移置5％CO₂溫箱37℃培養(yǎng)56h，加適量³H-TdR，繼續(xù)培養(yǎng)16h，結(jié)束后將細(xì)胞收集在玻璃纖維膜上，遞經(jīng)處理，最后用液體閃爍器測量，記錄每分鐘脈沖數(shù)(cpm)，算出3個(gè)復(fù)管的均數(shù)±S。通常以刺激指數(shù)(SI)表示轉(zhuǎn)化能力。

SI＝PHA刺激管cpm均值/對(duì)照管cpm均值

由于對(duì)照管組和刺激組實(shí)驗(yàn)條件一致，故用SI表示淋巴細(xì)胞增殖能力可以減少可變因素的干擾，但對(duì)照組同位素?fù)饺肓康脑黾踊驕p少，能使SI發(fā)生明顯變動(dòng)，以致有時(shí)不能反映真實(shí)的增殖情況，因此最好同時(shí)參照對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的cpm加以判斷。值得強(qiáng)調(diào)的是目前配制的PHA多為最適濃度，在該條件下，功能略遜的細(xì)胞仍有應(yīng)答能力。如同時(shí)采用最適和亞適濃度，一些細(xì)胞免疫功能較低的T細(xì)胞對(duì)亞適濃度的PHA則缺乏或僅呈極弱的應(yīng)答，故在一定程度上可識(shí)別出應(yīng)答功能較差的T細(xì)胞群。

二、T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn)

T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（lymphocytemediatedcytotoxicity，LMC)是細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL)的特性，凡致敏的T細(xì)胞再次遇相應(yīng)靶細(xì)胞抗原，可表現(xiàn)出對(duì)靶細(xì)胞的破壞和溶解作用，它是評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫水平的一種常用指標(biāo)，特別是測定腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，常作為判斷預(yù)后和觀察療效的指標(biāo)之一。該試驗(yàn)的原則是選用適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞，常用可傳代的已建株的人腫瘤細(xì)胞如人肝癌、食管癌、胃癌等細(xì)胞株，經(jīng)培養(yǎng)后制成單個(gè)細(xì)胞懸液，按一定比例與受檢的淋巴細(xì)胞混合，共溫一定時(shí)間，觀察腫瘤細(xì)胞被殺傷情況，常用方法如下：

（一)形態(tài)學(xué)檢查法

淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞混合共育后，以瑞氏染液著色，用顯微鏡計(jì)數(shù)殘留的腫瘤細(xì)胞數(shù)，計(jì)數(shù)淋巴細(xì)胞抑制腫瘤細(xì)胞生長的抑制率：

抑制率％＝（對(duì)照組平均殘留級(jí)腫瘤細(xì)胞數(shù)－實(shí)驗(yàn)組平均殘留細(xì)胞數(shù)／對(duì)照組平均殘留腫瘤細(xì)胞數(shù)×100％

（二)同位素法

一般采用¹²⁵I-UdR摻入法或⁵¹Cr釋放法，以細(xì)胞毒指數(shù)或⁵¹Cr釋放率表示T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。