外周血中單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞,其體積、形態(tài)和密度與其他細胞不同,紅細胞和多核白細胞密度較大,為1.090左右,而淋巴細胞和單核細胞密度為1.07payment-defi.com/zhuyuan/5~1.090,血小板為1.030~1.035。為此利用一種密度介于1.075~1.092之間而近于等滲的溶液(分層液)做密度梯度離心,使一定密度的細胞按相應密度梯度分布,從而將各種血細胞加以分離。常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種。
(一)Ficoll分層液法
主要用于分離外周血中的單個核細胞,是一種單次密度梯度離心分離法。聚蔗糖-泛影葡胺是一種較理想的細胞分層液,其主要成分是一種合成的蔗糖聚合物稱聚蔗糖(商品名為Ficoll),分子量為40kD,具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點。高濃度的Ficoll溶液粘性高,易使細胞聚集,故通常使用60g/L的低濃度溶液,密度為1.020,添加比重為1.200的泛影葡胺(urografin)以增加密度。國外常用商品Isopaque或Hypaque,故又稱Ficoll-Hypaque分層液,將適量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合適分層液。分離人外周淋巴細胞以密度為1.077±0.001的分層液最佳,因為人的紅細胞密度為1payment-defi.com/jianyan/.093,粒細胞密度為1.092,單個核細胞在1.076~1.090之間。而不同動物血中的單個核細胞對分離液的密度要求各不相同,如小鼠為1.088,馬為1.090。分離時先將分層液置試管底層,然后將肝素化全血以Hanks液或PBS液作適當稀釋后,輕輕疊加在分層液上面,使兩者形成一個清晰的界面。水平式離心后,離心管中會出現(xiàn)幾個不同層次的液體和細胞帶(圖20-1)。紅細胞和粒細胞密度大于分層液,同時因紅細胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積于管底。血小板則因密度小而懸浮于血漿中,唯有與分層液密度相當?shù)膯蝹核細胞密集在血漿層和分層液的界面中,呈白膜狀,吸取該層細胞遞經洗滌高心重懸。本法分離單個核細胞純度可達95%,淋巴細胞約占90%~95%,細胞獲得率可達80%以上,其高低與室溫有關,超過25℃時會影響細胞獲得率。
圖20-1 Ficoll分層液離心后外周血細胞示意圖
(二)Percoll分層液法
這是一種連續(xù)密度梯度離心分離法。Percoll是一種經聚乙烯吡喀烷酮(PVP)處理的硅膠顆粒,對細胞無毒性。利用Percoll液經高速離心后形成一個連續(xù)密度梯度的原理,將密度不等的細胞分離純化。用Percoll原液(密度1.135)與約等量雙離子強度的磷酸緩沖液均勻混合,高速離心后,使分層液形成一個從管底到液面密度逐漸遞減的連續(xù)密度梯度,再將已制備的單個核細胞懸液輕輕疊加在液面上,低速離心后,便得四個細胞層。表層為死細胞殘片和血小板,底層為粒細胞和紅細胞,中間有兩層,上層富含單個核細胞(75%),下層富含淋巴細胞(98%)(圖20-2)。該法是純化單核細胞和淋巴細胞的一各較好的方法,但操作流程較長,手續(xù)較多。
圖20-2 連續(xù)密度梯度離心法分離單個核細胞中各細胞成分的分布示意圖