中國(guó)幽門(mén)螺桿菌研究:經(jīng)口感染幽門(mén)螺桿菌制備大鼠胃炎模型的研究

1983年Marshall和Warrer從慢性胃炎和消化性潰瘍患者胃粘膜中分離出幽門(mén)螺桿菌（Hp)后，經(jīng)研究表明Hp與慢性活動(dòng)性胃炎關(guān)系密切，與消化性潰瘍的頑固不愈、早期復(fù)發(fā)有關(guān)。國(guó)外已有兩名志愿者口服Hp后引起活動(dòng)性胃炎并出現(xiàn)消化不良癥狀。但對(duì)動(dòng)物的感染較為因難，我國(guó)學(xué)者陳晶晶等于1991年報(bào)道了經(jīng)口感染8只Wistar大鼠成功，我們?cè)诖嘶�礎(chǔ)上對(duì)Hp感染大鼠胃炎模型進(jìn)行了進(jìn)一步研究，并取得了較為滿意的結(jié)果。

1　材料和方法

1.1　菌株

Hp菌株為本院胃鏡室胃鏡檢查患者胃組織鉗取物直接接種于空腸變曲菌選擇性培基上，微需氧條件，37℃培養(yǎng)72h，檢查菌落，革蘭染色陰性桿菌，呈變曲或S型。尿素酶、氧化酶、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性并傳代培養(yǎng)，做為感染大鼠的Hp。

1.2　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠32只，雌雄各半，5月齡，體重175g～256g。購(gòu)于白求恩國(guó)際和平醫(yī)院動(dòng)物室。按體重編號(hào)，隨機(jī)抽取8只做為空白對(duì)照。

1.3　感染方法

參照陳晶晶報(bào)道方法進(jìn)行。①將24只大鼠禁食12～14h，先用胃管喂以5％NaHCO₃2ml，5min后和胃管注入從培養(yǎng)基上沖洗下的Hp菌液1.5ml（108～1010cfu)，30min后給食。每周感染1次，共4次�？瞻讓�(duì)照組不即予感染Hp，飼養(yǎng)條件同制模組。②于最后一次感染Hp后7d～10d，分將空白對(duì)照組8只大鼠和隨機(jī)抽取模型組8只大鼠，禁食12～14h，用乙醚麻醉處死。用無(wú)菌生理鹽水洗去胃內(nèi)容物，從靠近幽門(mén)的不同部位，剪取胃粘膜組織4～5塊，直接做尿素酶試驗(yàn)，直接涂片，其余的胃組織用福爾馬林固定，常規(guī)制做病理切片，行HE和Warthin－Starry銀染色，供病理學(xué)檢查和Hp檢測(cè)。用于電鏡觀察的標(biāo)本用2.5％戊二醛固定。③感染結(jié)束后4周，再隨機(jī)抽取8只模型鼠，按上述方法取胃粘膜組織，檢測(cè)項(xiàng)目同上。④感染結(jié)束后8周，將所剩8只模型鼠按上述方法取胃粘膜組織，檢測(cè)項(xiàng)目同上。

1.4　細(xì)菌學(xué)檢查

①尿素酶試驗(yàn)：使用福建三強(qiáng)生物化工有限公司產(chǎn)SQ—H104半定量尿素酶試劑盒，按說(shuō)明書(shū)操作及判定結(jié)果。②胃粘膜直接涂片檢菌法：將大量鼠組織粘膜面在玻片上直接涂抹，涂勻后加熱固定，革蘭染色，鏡檢Hp。

1.5　病理學(xué)檢查

將福爾馬林固定的大鼠胃組織，石蠟payment-defi.com/job/包埋，切成6μm厚的組織切片，分別用HE和Warthin－Starry銀染色，觀察病理變化和檢查組織切片中Hp。

1.6　電鏡觀察

將2.5％戊二醇固定的標(biāo)本，用1％鋨酸后固定，常規(guī)Epon812樹(shù)酯包埋，半薄定位找到胃粘膜上皮細(xì)菌游離面，超薄切片厚50nm，常規(guī)鈾一鉛染色，JEM100csⅡ透射電鏡觀察。

1.7　Hp和炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

①Warthin－Starry銀染色Hp檢測(cè)分為A～D4級(jí)。A級(jí)：未見(jiàn)Hp；B級(jí)：偶見(jiàn)Hp；C級(jí)：Hp呈散在分布或成簇分布；D級(jí)：大量Hp。②中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)分為0～3級(jí)。0級(jí)：未見(jiàn)中性粒細(xì)胞；1級(jí)：偶見(jiàn)中性料細(xì)胞；2級(jí)：中性粒細(xì)胞散在或成簇分布；3級(jí)：大量中性料細(xì)胞浸潤(rùn)。③淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)分為0～3級(jí)。0級(jí)：未見(jiàn)淋巴細(xì)胞：1級(jí)：少量淋巴細(xì)胞；2級(jí)：淋巴細(xì)胞散在或成簇分布，3級(jí)：大量淋巴細(xì)胞。

2　結(jié)果

2.1　尿素酶試驗(yàn)與細(xì)菌學(xué)檢查

①模型組于感染結(jié)束時(shí)和感染后4周，8只大鼠胃粘膜尿素酶試驗(yàn)全部陽(yáng)性（分別為5例＋，3例++與4例+，4例++)；直接涂片鏡檢革蘭染色均查到散在Hp。對(duì)照組均為陰性。②感染后8W8只大鼠7只尿素酶試驗(yàn)陽(yáng)性（4例＋，3例++)，同時(shí)均查到Hp，對(duì)照組均為陰性。③胃粘膜組織切片Warthin－Starry銀染色除感染結(jié)束后8W時(shí)除1例未找到Hp外，其他均找到Hp（表1)。主要分布于粘液層，粘膜上皮細(xì)胞表面和粘膜隱窩處。切片中呈變曲型，S型。對(duì)照組大鼠胃粘膜組織中未找到Hp。

表1　各Hp檢出率　�。╪)

2.2　病理學(xué)檢查

感染Hp大鼠的胃組織切片均有病變（表2)。對(duì)照組8只大鼠中僅3例可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞，1例可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞。炎細(xì)胞浸潤(rùn)特點(diǎn)：炎癥分級(jí)中炎細(xì)胞浸潤(rùn)至粘膜細(xì)胞基膜附近；2級(jí)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)至粘膜下層；3級(jí)炎細(xì)胞浸潤(rùn)至胃壁全層。此與人類(lèi)慢性胃炎的炎細(xì)胞只浸潤(rùn)粘膜層有所不同。另外可見(jiàn)粘膜上皮細(xì)胞變性病灶，細(xì)胞腫脹而不規(guī)則，包漿內(nèi)結(jié)構(gòu)不清和消失，少數(shù)可見(jiàn)漿細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞。

表2　各組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度　　（n)

2.3　電鏡觀察

經(jīng)電鏡觀察有明顯病變：上皮細(xì)胞游離面質(zhì)膜粘裂或消失，胞質(zhì)粘液顆粒減少或變性，粘液顆粒內(nèi)容物變性，使顆粒有芯，猶如胃癌時(shí)出現(xiàn)的“蛙卵樣”粘液顆粒，或變成低電子密度空泡。胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器減少，呈空泡變性。細(xì)胞核畸形，嚴(yán)重者變性，染色質(zhì)邊集。粘膜內(nèi)嗜酸細(xì)胞增多。一份標(biāo)本粘液內(nèi)有一菌體斜面，考慮為Hp�？瞻讓�(duì)照組無(wú)病變，胃粘膜上皮細(xì)胞質(zhì)膜完整，腔面附有明顯粘液層，細(xì)胞游離端胞質(zhì)內(nèi)充滿粘液顆粒，細(xì)胞側(cè)面連接復(fù)合體明顯，胞質(zhì)細(xì)胞器豐富，常見(jiàn)線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。胞核較規(guī)則常染色質(zhì)較豐富。

3　討論

我們仿照陳晶晶的感染方法，對(duì)Hp感染W(wǎng)istar大鼠胃炎模型的制備進(jìn)行了進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究，采取較大劑量活躍菌株，多次重復(fù)感染方法獲得成功。感染保持時(shí)間較長(zhǎng)，感染后8周自然消失僅1例。研究結(jié)果表明：Hp對(duì)Wsitar大鼠尚屬易感。感染后所出現(xiàn)的病理變化與人類(lèi)Hp相關(guān)胃炎類(lèi)似，既有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)又有中性料細(xì)胞浸潤(rùn)。而Lambert感染悉生仔豬所制成的模型中性粒細(xì)胞只現(xiàn)于賁門(mén)部的非腺體區(qū)，不連貫且保持時(shí)間較短。本研究所制備的Wistar大鼠胃炎模型，其感染率、重復(fù)性及感染后出現(xiàn)的炎癥病變，均達(dá)到了做為Hp胃炎模型所需的指標(biāo)。模型制做的成功，將對(duì)推動(dòng)Hp致病機(jī)理、Hp相關(guān)性胃炎的防治等研究起到積極作用。