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您現(xiàn)在的位置: 醫(yī)學(xué)全在線 > 理論教學(xué) > 基礎(chǔ)學(xué)科 > 中國幽門螺桿菌研究 > 正文:用PCR-SSCP區(qū)分不同來源的幽門螺桿菌
    

用PCR-SSCP區(qū)分不同來源的幽門螺桿菌

  幽門螺桿菌(Hp)感染在人群中廣泛存在,Hp的分型鑒定對其感染的臨床及流行病學(xué)研究具有重要意義。國外文獻報道的幾種基因型技術(shù)使Hp的分型鑒定成為可能,而PCR及單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Signle-strand conformation polymorphisms,SSCP)分析在菌株分型鑒定中的應(yīng)用則尚未見報道。作者采用PCR-SSCP分析區(qū)分不同來源的Hp,并探討其應(yīng)用價值。

  1 材料和方法

  1.1 菌株來源 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11637,NCTC11848來自英國倫敦國家標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物收藏中心,由本院傳染科保存并提供;112株臨床分離鑒定的Hp來自97名因上胃腸癥狀在本院行胃鏡檢查的病人,經(jīng)內(nèi)鏡及病理診斷證實十二 指腸潰瘍49例,胃潰瘍5例,慢性胃炎43例。所有病人在內(nèi)鏡直視下于胃竇取粘膜活組織一塊做細(xì)菌培養(yǎng),其中包括1例未經(jīng)治療相融8個月復(fù)查胃鏡者,4名病人還另于胃底或十二指腸球部取粘膜活組織一塊做細(xì)菌培養(yǎng),10例十二指腸潰瘍伴Hp感染者于抗生素治療停藥4周復(fù)查胃鏡,取胃竇粘膜活組織兩塊分別做細(xì)菌培養(yǎng)及PCR方法直接檢測Hp。

  1.2 模板DNA的準(zhǔn)備 培養(yǎng)細(xì)菌或研碎的活檢胃粘膜以1%SDS100μg/ml蛋白酶k,55°C消化1h,以等體積苯本分氯仿-異戊醇(25:24:1)抽提,12000rpm離心10,吸取上層水相,加2.5倍體積冷無水乙醇12,000rpm離心10min沉淀DNA,以100μl無離子溶解DNA,1μl用于PCR擴增。

  1.3 PCR擴增Hp基因組 DNA203bp片段PCR引物CAM-2:5’-CATCTTGTTA-GAGGGATTGG-3’CAM-4:5’-TAA-CAAAAAGATAATGGCGC-3’,已證實對HpDNA特異,擴增片段長度為203bp。50μl含10mMTris(pH8.3),50mM KCL,1.5mM Mgcl2,0.01%明膠,各200μdNTP,各0.5μM CAM-2/CAM-4引物,1.25U TaqDNA聚合酶(中科院遺傳所產(chǎn)品)。反應(yīng)條件:94°C5min,1個循環(huán);94°C1min,55°C1min,72°C1.5min,35個循環(huán);72°C10min,1個循環(huán)。以HpNCTC11637DNA為陽性對照,去離子水做陰性對照。

  1.4 PCR產(chǎn)物的SSCP分析 PCR產(chǎn)物2μl以0.1M NaOH 2mM EDTA37°C變性10min,加3μl電泳加樣緩沖液(95%甲酰胺、0.5×TBE、0.25%溴酚藍(lán)、0.25%二甲苯腈藍(lán))混勻,于7.5%聚丙烯酰胺膠室溫電泳300V,3.5min,以0.19%硝酸銀染色30min,經(jīng)顯色液(1.5%NaOH,0.5%甲醛,0.0085%硼氰化鈉)顯色后觀察結(jié)果,比較不同Hp菌株兩條單鏈DNA片段的遷移情況。

  2 結(jié)果

  2.1 PCR-SSCP方法的重復(fù)性 相隔半年轉(zhuǎn)種得到5對Hp菌株,每對菌株203bpPCR產(chǎn)物的SSCP分析均顯示完全相同的單鏈構(gòu)象;同一菌株203bp PCR產(chǎn)物在不同聚丙烯酰胺膠上都呈現(xiàn)相同的單鏈構(gòu)象,使不同凝膠上菌株的PCR-SSCP分析具有可靠性。

  2.2 Hp基因組DNA203bp片段SSCP分析 不同Hp菌株203bp片段變性后的兩條單鏈,在中性聚丙烯酰胺膠中電泳的遷移率不同,從而形成不同的單鏈構(gòu)象。來自97名病人的分離菌株及2株標(biāo)準(zhǔn)菌株產(chǎn)生7種不同的單鏈構(gòu)象。通過比較不同的單鏈構(gòu)象。通過比較不同Hp菌株的單鏈構(gòu)象,將這97名病人的菌株分成6組(見表1)。同一病人相隔8個月分離培養(yǎng)的菌株,其203bpPCR產(chǎn)物的單鏈構(gòu)象穩(wěn)定不變;4個病人不同培養(yǎng)部位的4對Hp菌株分別具有相同的單鏈構(gòu)象。

表1 Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株來自97名病人的臨床分離菌株的分組情況

組別 菌 株 來 源 菌株總數(shù) 總百分?jǐn)?shù)(%)
十二指腸潰瘍 胃潰瘍 慢性潰瘍 標(biāo)準(zhǔn)菌株
1 32 5 35 1 73 73.74
2 10 0 6 0 161 6.16
3 3 0 1 0 4 4.04
4 2 0 1 0 3 3.03
5 1 0 0 0 1 1.01
6 1 0 0 0 1 1.01
7 0 0 0 1 1 1.01

  2.3 治療前后菌株的PCR-SSCP分析10例Hp感染者抗生素治療后停藥1月或1月以上復(fù)查,發(fā)現(xiàn)6例細(xì)菌培養(yǎng)仍為陽性,4例細(xì)菌培養(yǎng)陰性而PCR檢測仍為陽性。對這10例病人治療前后菌株的PCR-SSCP分析,發(fā)現(xiàn)9例病人治療前后的菌株具有相同的單鏈構(gòu)象,1例病人治療前后的單鏈構(gòu)象不同。對其中2例治療后僅PCR為陽性的患者,于停藥5個月~6個月復(fù)查時發(fā)現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)轉(zhuǎn)為陽性,并與治療前菌株具有相同的單鏈構(gòu)象(表2)

表2 10例Hp感染者治療前后菌株的PCR-SSCP分析

臨床診斷* 停藥間隔 菌株** PCR-SSCP分組
DU   93060B 1
  4周 9367a 1
  5個月 94123A 1
DU   93018B 1
  4周 9385a 1
NUD   93035B 2
  4個月 93104A 1
GU   93077B 1
  4周 9348A 1
  6個月 94124A 1
DU   93026B 1
  4周 93046A 1
NUD   93020B 3
  4周 93036A 3
DU   93028B 4
  6周 93055A 4
DU   93086B 1
  4周 94114A 1
DU   93089B 1
  4周 9392a 1
DU   93017B 2
  4周 93032A 2

  **B-治療前菌株;A-治療后菌株;a-治療后僅PCR陽性

  表2中同時列出不同組別菌株的疾病來源,未發(fā)現(xiàn)不同組別的菌株與某一疾病有確定的關(guān)系,未發(fā)現(xiàn)與十二指腸潰瘍或胃潰瘍密切相關(guān)的Hp菌株。

  3 討論

  不同Hp菌株DNA分子具有多態(tài)性,PCR-SSCP分析作為檢測DNA多態(tài)及基因突變的方法,有可能檢出這一多態(tài)性,從而區(qū)分不同來源的Hp菌株。本研究用PCR-SSCP分析鑒別不同Hp菌株方法簡單、可靠、重復(fù)性好,通過比較97名病人的臨床分離菌株及2株標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA203bp片段的兩條單鏈DNA,在聚丙烯酰胺膠中的電泳遷移率,將這些被檢菌株分成7組,表現(xiàn)出中等度的分辨力。它雖然不能將所有不同病人來源的菌株逐一區(qū)分,但可對流行病學(xué)上某特定人群的菌株分組從而可以比較不同人群中感染的Hp有無差異。

  本研究中顯示74%的菌株具有相同的單鏈構(gòu)象,推測可能是北京市區(qū)人群Hp感染的主要菌型。本結(jié)果還證實同一病人相隔8個月分離的菌株,其203bp片段的單鏈構(gòu)象穩(wěn)定不變,這與文獻中報道的同一病人2年內(nèi)連續(xù)分離的多株Hp,其染色體DNA酶切圖型保持不變的結(jié)果相似。對來自4名病人不同部位的4對Hp菌株的PCR-SSCP分析,未發(fā)現(xiàn)同一病人有不同類型Hp菌株的混合感染。Petwett等用Southern印跡法對來自15個病人的胃竇、胃體及十二指腸球部的64株Hp核糖型分析,發(fā)現(xiàn)2個病人分別感染了兩株不同的Hp。本文觀察的病人數(shù)不多,尚難做結(jié)論。

  對10名病人治療前后菌株的PCR-SSCP分析,發(fā)現(xiàn)9名病人治療前后的菌株具有相同的單鏈構(gòu)象,認(rèn)為是治療后同一菌株的復(fù)發(fā)。1名病人治療前后的菌株單鏈構(gòu)象不同,可能是治療后獲得了新菌株的再感染,或藥物治療導(dǎo)致原來感染的菌株變異但也不排除兩株不同類型Hp菌株混合感染的可能。PCR-SSCP分析用于治療后Hp復(fù)發(fā)和再感染的鑒別與文獻報道相類似,但由于不同Hp菌株也可有相同的SSCP圖型,使該方法對治療前后菌株的鑒定不夠精確,進一步研究可通過選擇擴增DNA多態(tài)性更為顯著的片段,或許可以對治療前后菌株復(fù)發(fā)及再感染做出更精確的判斷。PCR-SSCP方法用于治療前后菌株的鑒定,可以從活檢胃粘膜中直接增出DNA片段用于SSCP分析,省卻了細(xì)菌培養(yǎng)的繁瑣耗時的過程,特別適用于那些治療后細(xì)菌培養(yǎng)無法檢出,而實際上仍然少量存在的Hp菌株的鑒定,這是其它菌相提并論鑒定方法難以達(dá)到的。研究表明,Hp存在著致病力不同的兩組菌株,它們致病力的不同表現(xiàn)在與不同的病癥的關(guān)系上。Tee等用Southern印跡法對Hp核糖帶型的研究,未發(fā)現(xiàn)Hp的核糖型或核糖型的某條帶與臨床疾病有對應(yīng)關(guān)系、Yoshimara等用DNA-DNA雜交技術(shù)證實,十二指腸潰瘍和無癥狀胃炎病人感染的Hp有明顯的遺傳學(xué)差別。本研究對不同Hp菌株基因組DNA203bp片段的SSCP分析,未發(fā)現(xiàn)與臨床某一疾病相關(guān)的細(xì)菌DNA單鏈構(gòu)象,可能由于該片段編碼的信息與Hp的致病力無關(guān),對Hp毒素相關(guān)基因的分析或許可以發(fā)現(xiàn)與不同疾病表現(xiàn)相關(guān)的菌株,有待今后進一步研究。

王蔚虹1 胡伏蓮1 賈博琦1 瞿峰2 朱立煌2

1北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院胃腸科(100034)

2中國科學(xué)院遺傳研究所

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