網(wǎng)站首頁
醫(yī)師
藥師
護(hù)士
衛(wèi)生資格
高級職稱
住院醫(yī)師
畜牧獸醫(yī)
醫(yī)學(xué)考研
醫(yī)學(xué)論文
醫(yī)學(xué)會議
考試寶典
網(wǎng)校
論壇
招聘
最新更新
網(wǎng)站地圖
您現(xiàn)在的位置: 醫(yī)學(xué)全在線 > 理論教學(xué) > 基礎(chǔ)學(xué)科 > 中國幽門螺桿菌研究 > 正文:幽門螺桿菌全菌抗原與尿素酶抗原ELISA血清學(xué)檢測的應(yīng)用
    

幽門螺桿菌全菌抗原與尿素酶抗原ELISA血清學(xué)檢測的應(yīng)用

  大量研究資料證明,幽門螺桿菌(H.pylori,Hp)是人類慢性胃炎消化性潰瘍的重要致病菌且與胃癌的發(fā)生密切相關(guān)。它可通過胃粘膜活檢組織尿素酶試驗和Hp培養(yǎng)來診斷其感染,但病人必須接受胃鏡檢查,由于檢查時痛苦較大,更不易被復(fù)查和隨訪患者接受。Hp的尿素酶抗原可刺激機(jī)產(chǎn)生高滴度的循環(huán)抗體,其中IgG抗體滴度在未經(jīng)系統(tǒng)抗Hp治療的人群中,能確切地反映人體內(nèi)目前有無Hp感染,在感染病人經(jīng)抗Hp治療殺滅了體內(nèi)Hp3~6個月后,IgG抗體滴度能下降25%~50%,因此可客觀地反映治療效果。

  1 材料和方法

  1.1 血液標(biāo)本

  血液標(biāo)本676例患者,平均年齡43.5歲(18歲~87歲),主要癥狀為上腹痛及(或)食后上腹脹、惡心或嘔吐、燒灼感染、反酸、噯氣、食欲不振。少數(shù)病例經(jīng)胃鏡檢查,結(jié)果正常胃炎等器質(zhì)性病變。采取肘靜脈血2ml進(jìn)行檢測。

  1.2 Hp尿素酶純化抗原的制備

  ①菌株選擇及細(xì)菌培養(yǎng):實(shí)驗選擇尿素酶活性高的Hp菌,接種含6%脫纖維羊血的布氏平皿中,置混合氣體(5%O2、10%CO2和85%N2)環(huán)境中,37℃培養(yǎng)3d后收菌。②細(xì)菌破碎及預(yù)處理:將收集之Hp菌用生理鹽水洗2遍后,用凝膠過濾洗脫液將菌稀釋至15億菌/ml,用超聲波在冰浴中進(jìn)行破碎后,經(jīng)高速離心12000r/min,30min后取上清備用。③凝膠過濾用SephadesG200柱進(jìn)行,洗脫液測定尿素酶活性并將其活性峰與相應(yīng)菌全菌蛋白,上柱液及離心沉渣進(jìn)行SDS-PAGE分析,觀察尿素酶提純效果,Western blot分析是將尿素酶活性峰,經(jīng)SDS-PAGE將各蛋白分離后,經(jīng)電泳將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,處理、染色照相,并記錄結(jié)果。

  1.3 血清抗Hp尿素酶抗體的檢測

  血清抗Hp尿素酶抗體的檢測:采用ELISA(按照Kesumen法改良),檢測對象為門診受診的各類胃病患者共676例,經(jīng)純化尿素酶抗原包被的40孔(或96孔)酶標(biāo)板,用0.5%明膠0.1ml37℃作30min封閉,用洗滌液洗板三次,加入待檢血清并以特異性抗HpU抗體的含量為66μg/ml標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作為判斷村準(zhǔn)。加二抗HRP SPA,用PBST20稀釋后,每孔加入0.1ml,37℃孵育30min,洗板3次后,在避光條件下與底物液中加入適量30%過氧化氫及鄰苯二胺,溶解后,每孔加入0.1ml,37℃孵育,顯色5min~10min,加2mol/LH2SO4終止液每孔0.1ml,用49nm波長測吸光度(A)[舊稱光密度(OD),下同](或目測)。目測觀察:顏色淺于或等于標(biāo)準(zhǔn)陽性對照者為陽性,顏色深于標(biāo)準(zhǔn)陽性對照者為陰性。儀器測定:以酶標(biāo)儀測定各孔吸光度(A)大于或等于標(biāo)準(zhǔn)陽性對照者為陽性,吸光度(A)小于標(biāo)準(zhǔn)陽性對照者為陰性。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)性對照吸光度(A)大于或等于0.2時,若陰性對照吸光度(A)小于0.1則試劑盒有效。ELISA特異性經(jīng)吸收試驗鑒定,確定與空腸變曲菌(C.jejuni)、結(jié)腸變曲菌(C.coli)及海變曲菌(C.laris)無交叉反應(yīng)。

  2 結(jié)果

  2.1 HpU抗原純化 

  應(yīng)用SephadesG200柱,從Hp超聲破碎物離心上清液中,一次性提純了Hp尿素酶抗原。SDS—PAGE分析結(jié)果表明,所提取的Hp尿素酶抗原中僅含有66KD及30KD兩種蛋白成分,與Hp尿素酶蛋白兩種亞基的大小完全相同,提取物中幾乎不含有其他雜蛋白成分,經(jīng)Western blot分析,證明所提純的Hp尿素酶抗原仍具有良好的抗原性。

  為了檢測HpU純化抗原的敏感性與特異性,實(shí)驗選擇經(jīng)Hp全菌蛋白抗原對人血清特異性抗Hp-IgG抗體檢測的陽性及陰性各類胃。詼\表性胃炎、慢性萎縮性胃炎等)患者血清各50份進(jìn)行對比研究,結(jié)果用混合多型HpU純化抗原比全菌蛋白抗原為敏感,且特異性高(表1)。

表1 Hp全菌抗原與尿素酶純化抗原ELISA法檢測比較

 

 

Hp全菌抗原

陽性份數(shù)

陰性份數(shù)

合計

HpU抗原

陽性份數(shù)

50

0

50

陰性份數(shù)

6

44

50

 

合計

56

44

100

X2=6.38,P>0.025

  2.2 人血清特異性抗HpUIgG抗體的測定:用目測和酶標(biāo)儀測定胃病患者人群中血清抗HpUIgG抗體。按表2分析,以特異抗HpU抗體的含量為66μm/ml標(biāo)準(zhǔn)陽性血清作為判斷標(biāo)準(zhǔn),ELISA法與免疫印跡分析對照,敏感性為98%,特異性為96%。

表2 676份病人血清抗幽門螺桿菌尿素酶抗體ELISA檢測結(jié)果

 

ELISA

合計

陽性份數(shù)

陰性份數(shù)

Western陽性份數(shù)

375

8

383

Blot陰性份數(shù)

19

274

293

合計

394

282

676

  3 討論

  Hp是人胃內(nèi)唯一產(chǎn)生高活性尿素酶的細(xì)菌,可通過檢測胃內(nèi)尿素酶的活性來診斷Hp感染,現(xiàn)已發(fā)展了多種檢測方法,如14N尿素酶排泄試驗。13C或14C呼吸試驗,均有較高的敏感性和特異性,但是以上幾種方法均需要特殊的檢驗設(shè)備和技術(shù),不易在基層推廣和應(yīng)用,因此血清中Hp特異性抗體的檢測,在檢出與Hp相關(guān)性胃炎的診斷中尤為重要,與侵入性診斷方法或呼吸試驗相比,血清學(xué)診斷易為患者接受,而ELISA法則更為常用,若用患者自身菌株作抗原較用標(biāo)準(zhǔn)菌株作抗原在ELISA試驗中更能觀察到明顯的IgG滴度。

  目前應(yīng)用于ILISA抗原有三類:①全細(xì)胞抗原和超聲粉碎物抗原;②部分純化抗原;③高度純化抗原。Hp全菌細(xì)胞和未純化的細(xì)胞超聲波粉碎物抗原,用于Hp感染的血清學(xué)診斷一般特異性不高。用Hp多種抗原制品的混合物純化的純化尿素酶組分抗原,則可獲較高的特異性與敏感性。

  實(shí)驗采用ELISA法對676份人血清進(jìn)行了抗HpU抗體的檢測,以特異性抗HpU抗體的含量為66μg/ml標(biāo)準(zhǔn)陽性血作為判斷標(biāo)準(zhǔn),其敏感性及特異性各為98%及96%。

  對于Hp陽性的慢性胃炎,抗菌治療是一種新的治療方法,我們已往研究表明慢性胃炎,尤其是活動性胃炎與Hp感染更是密切相關(guān),在抗菌治療前后用ELISA法檢測血清Hp抗體,抗菌治療后抗體滴度明顯下降,與Hp清除有關(guān),炎癥程度減輕(活動性胃炎癥消失)具有相關(guān)性。非潰瘍性消化不良(NUD)是常見的臨床癥候群,目前對其病因認(rèn)識尚不清楚,一般認(rèn)為是多樣性(heterogeneous),其中慢性胃炎占很大比例,而與Hp感染密切相關(guān),經(jīng)胃鏡胃粘膜活檢有半數(shù)以上有Hp存在,故認(rèn)為Hp在NUD病人中有一定致病作用。人群血清抗HpU抗體ILISA法檢查,屬于創(chuàng)傷檢測,可用作初篩檢查,以后隨訪,可免去病人多次胃鏡檢查之苦,節(jié)省不必要的檢查費(fèi)用,減少交叉感染機(jī)會,有較好的依從性(compliance)和可靠性。總之,用血清抗HpU抗體ELISA法檢測,對于慢性胃炎及非潰瘍性消化不良中Hp抗體的檢出,抗菌治療方案的確定,抗菌治療方案的隨訪與評價及流行病學(xué)調(diào)查研究,是一項簡便、可靠、實(shí)用的方法。

本課題為國家自科學(xué)基金資助項目

陳晶晶1 楊昭徐2 蔣秀高1 張建中1 梁丕霞2

1中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物研究所(北京102206)

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院(100050)

關(guān)于我們 - 聯(lián)系我們 -版權(quán)申明 -誠聘英才 - 網(wǎng)站地圖 - 醫(yī)學(xué)論壇 - 醫(yī)學(xué)博客 - 網(wǎng)絡(luò)課程 - 幫助
醫(yī)學(xué)全在線 版權(quán)所有© CopyRight 2006-2026, MED126.COM, All Rights Reserved
浙ICP備12017320號
百度大聯(lián)盟認(rèn)證綠色會員可信網(wǎng)站 中網(wǎng)驗證