4.RNA酶溶液
取RNA酶A溶解于100ml DEPC水中,分裝成小份(1ml,10mg/ml),-20℃儲存。
臨用前,取RNA酶A儲備液,用2×SSC溶解配成工作液(0.01mg/ml).
5.0.2%
取2ml Triton X-100加入998ml PBS中,充分振蕩使其充分混合。
七、雜交用液
1.SSC(Standard Saline Citrate, SSC)
通常配成10×,20×,50×的儲備液,如下:
配制:先稱取上述兩種試劑,溶于約800ml ddH2O中,滴加10N的NaOH,將pH值調(diào)至7.0,補(bǔ)足ddH2O至1000ml,加入終濃度為0.1%~0.2%的DEPC,分裝后高壓滅菌,可室溫保存。
該液主要用于配制予雜交液及雜交后的各種洗脫液,以保持一定的離子強(qiáng)度。此外,在用于雜交的濕盒內(nèi)也常用5×的SSC以保持一定濕度。
2.Denhardt’s液
通常配成10×,50×或100×的儲備液
配制:稱取上述試劑,溶于800ml左右滅菌ddH2O中,定容至1000ml后,過濾后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/P>
該液用于配制雜交液及予雜交液等。
3.雜交液及予雜交液
※:臨用前加;△予雜交液不加
配制:先以去離子甲酰胺與SSC于室溫混合,加入硫酸葡聚糖于50℃促溶,依次加入其它成份。硫酸葡聚糖在室溫常需數(shù)小時才能完全溶解。有時需旋渦振蕩。定容后充分混合。根據(jù)使用方便可分裝(最好用鋁箔將瓶子包好)存于4℃,可達(dá)數(shù)月。注意,雜交緩沖液在使用前切忌污染。
變性被打斷的無關(guān)DNA(常為鮭精DNA或鯡精DNA)可在予雜交及雜交前加入。此外,有許多物質(zhì)如肝素、多聚腺甘酸、醋酸鈉等多種成份,可根據(jù)需要加入雜交液中,上述配方所列只是不可缺少的基本成份。
配制好的雜交液不宜反復(fù)凍融,否則易產(chǎn)生硫酸葡聚糖沉淀現(xiàn)象。使用前最好加熱至50℃,使其充分溶解后再加入探針分子。至于探針的濃度視實驗?zāi)康摹⑻结橆愋图皹?biāo)記方法而異。通常RNA探針分子濃度為0.5~2μg/ml,DNA探針濃度為1μg/ml,此外,如使用35S標(biāo)記的探針,還需加入終濃度為100mmol/L的二硫蘇糖醇(Dithiothreitol,DTT)至雜交液及雜交后的洗脫液中。
八、雜交后漂洗溶液
無論用何種標(biāo)記方法及何種信號顯示方法,在雜交后洗脫則是大同小異。在此,歸納幾種帶有共同性及常用的洗脫液。
該液常用于雜交后的初次洗脫,故離子強(qiáng)度(張力)較高。
該液常用于雜交后的第二次洗脫,離子強(qiáng)度較低,經(jīng)過上述兩套洗脫液洗后,有的還可用2×SSC,10%(0.1%)SDS洗脫。
主要是洗去殘留的RNA,降低背景。用于以RNA為探針的原位雜交方法中。