綜合性實驗一 膿汁和糞便標本中病原菌的檢測
從臨床標本中分離細菌的目的是為了查找與疾病有關的病原菌，這對于臨床治療及預后調查是很有價值的。所以，在分離時應掌握以下原則，以便指導檢出病原菌，避免漏診誤診。
1．了解微生物在人體的分布。人體的很多部位與外界相通，存在正常菌群，分離時應注意
標本中的菌群是正常菌群的污染，還是致病菌。另外，機體的某些部位(如血液、骨髓)是
無菌的，如檢出細菌，應視為致病菌。
2．了解標本來源及臨床情況，以便有目的地檢出病原菌。
3．根據(jù)標本來源和可能存在的病原菌確定選用各種分離培養(yǎng)基，以提高檢出率。如血平板
常見的化膿性病原菌有葡萄球菌、鏈球菌、淋球菌、腦膜炎球菌、肺炎鏈球菌、結核桿菌、
假單胞菌、流感桿菌等。膿汁標本在做細菌分離培養(yǎng)的同時，均須直接涂片檢查，觀察是否有
典型形態(tài)的菌體，芽胞有無，為臨床提供最初的診治依據(jù)。
糞便標本中常含有很多雜菌，應根據(jù)檢驗目的菌的不同而選擇培養(yǎng)基(如SS、伊紅美藍平板，堿性蛋白胨水)，盡可能地抑制雜菌，以利于病原菌的檢出。糞便標本中常見的病原菌有
志賀氏菌屬、致病性大腸桿菌、弧菌屬、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、艱難梭菌等。糞便標
本中因各種正常菌群含量甚多，僅以染色性和形態(tài)無法分辯是否為病原菌，因此，糞便標本
一般不作直接涂片檢查，只有檢查霍亂弧菌、結核桿菌、疑似葡萄球菌或艱難梭菌引起的偽
膜性腸炎，以及菌群失調時，才作直接涂片檢查。
細菌鑒定工作的原則及基本方法是：
1、必須用純的細菌培養(yǎng)物作鑒定。因為不同的細菌生化反應結果相差較大，而反應結果是
以陽性或陰性表示的，一旦用混合菌做生化反應，結果不可分析。
2、鑒定方法的選擇。測定細菌特征的實驗方法很多，應根據(jù)鑒定目的選擇有價值的、快速
簡便的試驗項目，既能完成鑒定，試驗項目又盡可能少。
一、 培 養(yǎng) 基 的 制 備
Preparation of Culture Media
【實驗目的】
1了解細菌生長的基本營養(yǎng)條件。
2熟悉培養(yǎng)基的種類。
3掌握培養(yǎng)基制備的原則和一般方法。
【實驗原理】
培養(yǎng)基是用人工方法將微生物生長繁殖所需要的多種營養(yǎng)物質，按比例混合配制而成的營養(yǎng)
制品，其主要用途是分離培養(yǎng)純種微生物，傳代或保存微生物，鑒別微生物的種屬，研究微
生物的生理及生化特性，制造疫苗、微生態(tài)制劑或其他微生物制劑。
培養(yǎng)基基本成分包括：(1)營養(yǎng)物質，如碳源、氮源、無機鹽和生長因子等；(2)水份；(3)
凝固物質，最常用的凝固劑為瓊脂；(4)抑制劑，如膽鹽、抗生素等，其目的是抑制非檢出
菌的生長或使其少生長，有利于檢出菌的生長。
培養(yǎng)基的種類很多，根據(jù)物理性狀，培養(yǎng)基可分為固體、半固體和液體培養(yǎng)基三種，固體培
養(yǎng)基又有平板和斜面之分。根據(jù)用途，培養(yǎng)基可分為：
(1)基礎培養(yǎng)基含有一般細菌生長繁殖需要的最基本的營養(yǎng)物質
，可作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎成分。
(2)營養(yǎng)培養(yǎng)基在基礎培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質如血液、
血清或生長因子等，用以培養(yǎng)營養(yǎng)要求較高的微生物。
(3)選擇性培養(yǎng)基利用微生物對某些化學物質的敏感
性不同，在培養(yǎng)基中加入這類物質，
抑制不需要的微生物生長，有利于所需分離的微生物生長，從而達到分離或鑒別某種微生物
的目的。
(4)鑒別培養(yǎng)基是一類含有某種特定化合物或試劑的培養(yǎng)基。某
種微生物在這種培養(yǎng)基上
培養(yǎng)后，產生某種特定代謝產物，與這種特定的化合物或試劑能發(fā)生某種明顯的特征性反應
。
培養(yǎng)基的制備原則：(1)適當?shù)臓I養(yǎng)成分；(2)合適的酸堿度；(3)配制后經滅菌手續(xù)使之無
菌，方可使用。將滅菌后的培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)24小時，必須無細菌生長。
培養(yǎng)基制備程序可分為調配、溶化、矯正pH、分裝、滅菌、檢定及保存等步驟。制備好的培
養(yǎng)基，應注明名稱、制作日期，存放在4℃冰箱中。
【實驗內容和方法】
一肉湯培養(yǎng)基(meat infusion broth)的制備
供作一般細菌培養(yǎng)的基礎培養(yǎng)基，其成分為：
牛肉浸膏3g
蛋白胨10g
NaCl5g
蒸餾水1000ml
pH7.4～7.6
【材料】
天平稱量紙藥勺pH試紙(pH5.4～9)三角燒瓶量筒試管試管架5ml吸管吸
頭棉塞標簽紙牛皮紙線繩
【方法】
1稱取一定量的肉湯培養(yǎng)基，置于三角燒瓶中，加入適量的蒸餾水。
2溶解后校正pH至7.4～7.6，分裝到三角燒瓶或試管中(裝量以試管高度的1/4左右為宜)。
多數(shù)生化試驗用的鑒別培養(yǎng)基，可分裝于毛細玻璃管內，加熱熔封，滅菌后備用。
3三角燒瓶和試管口塞上用普通棉花制作的棉塞(棉塞的形狀、大小和松緊要合適，才能起
到防止雜菌侵入培養(yǎng)基內而造成污染和有利通氣的作用)，在棉塞外包一層牛皮紙，以防滅
菌時冷凝水沾濕棉塞。
4貼上標簽，滅菌后使用。
二普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(nutrient agar)的制備
瓊脂是從海藻中提取的一種膠體多糖類物質，一般不被細菌分解利用，故對細菌無營養(yǎng)作用
，其特點是能在100℃溶化、40℃以下凝固，因此，它是作為固體培養(yǎng)基賦形的理想凝固劑
。將不同量的瓊脂加入肉湯中趁熱可制成斜面、平板等不同類型的固體培養(yǎng)基(含瓊脂2～2.
5%)或半固體培養(yǎng)基(含瓊脂0.3～0.5%)，供分離、培養(yǎng)、傳代和保存細菌等使用。
【材料】
普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基蒸餾水三角燒瓶平皿試管5ml吸管酒精燈
【方法】
1在上述配制的肉湯培養(yǎng)基中加入2－2.5%的瓊脂，或者稱取一定量的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，置
于三角燒瓶中，加入適量的蒸餾水。
2滅菌后冷卻至50～60℃(以防止冷凝水太多)時，以無菌操作傾入已滅菌的平皿中制成平
板。若平皿內徑為9cm，可傾注12～15ml；若內徑為7cm的平皿，傾注10～12ml。輕輕搖動平
皿底部，待凝固后即成。
3如果要制作斜面，滅菌前將培養(yǎng)基溶化、分裝到試管中(裝量不超過試管高度的1/5)，滅
菌后趁熱斜放，冷卻后即成斜面(斜面的長度不超過試管總長的1/2)。
4如果要制作半固體培養(yǎng)基，分裝量可為試管長度的1/4～1/3，滅菌后趁熱直立待凝。
三血平板(blood agar)的制備
適于各類細菌生長，鏈球菌、肺炎球菌等營養(yǎng)要求較高的細菌必須要用血平板。一般細菌檢
驗標本的分離多應接種血平板。在血平板上除了可以觀察菌落的形態(tài)外，還可判斷溶血情況
。
【方法】
1將已滅菌的普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化。
2冷卻至50℃左右時，加入10%無菌脫纖維羊血(臨用前，應置于37℃水浴預溫)，輕輕搖勻
。
3以無菌操作傾入滅菌的空培養(yǎng)皿中。
四、伊紅美藍(EMB)培養(yǎng)基的制備
分離腸道致病菌用，其成分為：
牛肉浸膏5g
蛋白胨10g
氯化鈉5g
瓊脂15g
乳糖10g
蒸餾水1000ml
無菌2%伊紅Y水溶液 20ml
無菌0.5%美藍水溶液20ml
pH7.2～7.4
注：
伊紅、美藍為指示劑，且有抑制革蘭氏陽性菌生長的作用。大腸桿菌分解乳糖產酸，使伊紅
與美藍呈色，形成紫黑色菌落，且有金屬光澤；腸道致病菌不發(fā)酵乳糖，菌落呈粉紅色，有
時可因堿性物質較多，細菌帶負電荷染上美藍而呈藍色菌落。
【方法】
1加熱溶化已滅菌的蛋白胨、肉湯瓊脂，溶化后立即趁熱加入已滅菌的乳糖。
2待冷卻至50～60℃時，加入已滅菌的伊紅及美藍水溶液，充分搖勻。
3以無菌操作傾注平皿。凝固后，冷藏備用。
【注意事項】
●攪拌或振蕩器皿或延長放置時間，以促進干燥培養(yǎng)基的溶解。
●干燥培養(yǎng)基一般已校正pH。用時須再驗證。通常培養(yǎng)基滅菌后pH約可降低0.1～0.2，在矯
正時應比實際需要的pH提高0.1～0
.2。
●傾注培養(yǎng)基時，切勿將皿蓋全部啟開，以免空氣中塵埃及細菌落入。
●瓊脂平板放4℃冰箱保存，正面向下(倒置)，以防細菌落入而污染。
●新制成的平板培養(yǎng)基表面水分較多，不利于細菌的分離，可將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱內約
30分鐘，待平板表面干燥后使用。
【思考題】
①人工培養(yǎng)細菌需要提供的條件是什么?
②培養(yǎng)基制備的原則是什么?
③如何證明培養(yǎng)基滅菌是否徹底?
④怎樣檢查培養(yǎng)基是否合格?
⑤培養(yǎng)基按物理形狀分哪幾種?各有何用途?
二、 消毒與滅菌
Disinfection And Sterilization
【實驗目的】
1了解理化因素對細菌的影響。
2掌握常用的消毒滅菌法。
【實驗原理】
微生物廣泛存在于周圍環(huán)境，其中有些又是病原微生物，因此，從預防感染出發(fā)，醫(yī)務工作
者必須建立無菌觀念和嚴格執(zhí)行無菌操作，這就要求必須對所用的物品(如注射器、手術器
械、手術衣等)和工作環(huán)境(如無菌操作室、手術室、產房等)進行滅菌或消毒，以確保所用
的物品和工作環(huán)境的無菌或處于無菌狀態(tài)；為防止疾病的傳播，對傳染病患者的排泄物和實
驗廢棄的培養(yǎng)物亦須進行滅菌或消毒處理。微生物學實驗一般都需要在無菌條件下進行，為
此必須對培養(yǎng)基、實驗器材和試劑等進行滅菌，并嚴格執(zhí)行無菌操作。可見，消毒與滅菌是
微生物學和臨床醫(yī)學必不可少的基本知識。
物理滅菌方法有干熱滅菌、濕熱滅菌、過濾滅菌等，可根據(jù)具體情況選用不同的滅
菌法。干熱滅菌有火焰燒灼滅菌和熱空氣滅菌兩種。火焰燒灼滅菌適用于接種環(huán)、接種針和
鑷子等，無菌操作時的試管口、瓶口也可在火焰上作短暫燒灼滅菌。
煮沸100℃經5～10分鐘，可殺死細菌的繁殖體，但不能殺死細菌的芽胞。因此，煮沸法
主要用于一般外科手術器械、膠管和注射器等的消毒，亦可用于飲水和食具的消毒。
高壓蒸汽滅菌法是實驗室中最常用最有效的方法。水在大氣壓中100℃左右沸騰，大氣壓增
加沸騰溫度將隨之增加。因此，在密閉的高壓滅菌器內，當蒸汽壓增加到1.05kg/cm2(15
磅)
時，溫度則達到121.3℃，在這種溫度下，15～30分鐘即可殺死所有微生物及細菌的芽胞。
凡能耐高熱和潮濕的物品如培養(yǎng)基、生理鹽水、紗布、手術器械、注射器、玻璃器材等都可
應用高壓蒸汽滅菌法滅菌。
過濾除菌法適用于除去糖溶液、血清培養(yǎng)基、藥物等不耐熱液體中的細菌，所用設備為濾菌
器，由孔徑細小，能阻擋細菌通過的纖維素膜、陶瓷板、石棉板等制成。各種濾膜或濾板的
濾孔大小不同，可供選擇。
波長200～300nm之間的紫外線具有殺菌能力，尤以波長為260nm殺菌能力最強。紫外線通過
干擾細菌DNA的復制而使細菌死亡。因紫外線穿透力不強，可被普通玻璃及紙片吸收，所以
常用于實驗室、手術室、傳染病房等的空氣及物體表面的消毒。紫外線燈距照射物以不
超過1.2米為宜，照射20～30分鐘即可殺死空氣中的細菌。
化學消毒劑一般對病原微生物和機體都有毒性，因此只能用于物品、周圍環(huán)境以及人體體表
局部的消毒。消毒劑的作用原理：(1)使菌體蛋白質變性或凝固，如含汞的重金屬鹽類、龍
膽紫、酒精、甲醛等；(2)破壞細菌的酶系統(tǒng)，如高錳酸鉀、雙氧水、碘液、漂白粉等
；(3)改變細菌細胞壁或細胞膜的通透性，如新潔爾滅、肥皂、來蘇兒等。
圖1手
提式高壓蒸汽滅菌器示意圖
1.螺栓2.銷子3.器身4.蓋子5.安全閥
6.提把7.壓力表8.螺母9.排氣閥10.排氣管
11.提柄12.密封墊圈13.內桶14.篩片
【實驗內容和方法】
一高壓蒸汽滅菌法(autoclaving)
手提式高壓蒸汽滅菌器(見圖1)是一雙層筒狀金屬容器，兩層之間盛水，外筒堅厚，上端有
蓋，蓋旁附有螺旋，使用時將螺旋扭緊，使蓋緊閉蒸汽不能外溢。蓋上裝有排氣閥門和安全
閥門，以調節(jié)器內蒸汽壓力，壓力表表示內部溫度和壓力。內筒用于盛放欲滅菌的物品。
【方法】
1先向器內加水，然后把要滅菌的物品裝入內筒，將器蓋蓋好，擰緊螺旋。
2打開排氣閥門，加熱，待冷空氣完全排出后再關閉排氣閥，繼續(xù)加熱。
3待器內壓力上升到所需數(shù)值(一般為15磅)時，減少爐火，使壓力維持不變，約15～30分
鐘。
4關閉熱源，自然放涼，待壓力表指針下降到零后，打開排氣閥，開蓋取物。
【注意事項】
●滅菌時，應嚴格按操作程序進行，切勿擅自離開，尤其是升壓和保壓期間要注意壓力表指
針的變化，避免壓力過高而導致培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分被破壞，以及意外事故的發(fā)生。
●高壓蒸汽滅菌時，必須待器內冷空氣完全排出后才可關閉排氣閥加壓，否則即使壓力達到
15磅，溫度也達不到121℃，不能達到滅菌效果。
●務必待壓力下降到零時，方可開蓋，否則會因器內壓力驟然下降，致使瓶內液體沖出瓶外
。
●現(xiàn)在最常用的培養(yǎng)基滅菌條件是15磅15分鐘，時間過長有可能破壞培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分。含
糖的生化培養(yǎng)基的滅菌條件是10磅(115.6℃)15分鐘。器皿的滅菌可以是15磅20分鐘。
二、紫外線殺菌試驗(germicidal test of UV)
【材料】
大腸桿菌肉湯培養(yǎng)物普通營養(yǎng)瓊脂平板滅菌的L形玻璃棒滅菌的“A”字形黑紙片
【方法】
1通過無菌操作，用接種環(huán)沾取大腸桿菌菌液放到平板培養(yǎng)基上，然后用滅菌的L形玻璃棒
均勻涂布于整個平板。
2鑷子在火焰上滅菌后，夾取滅菌的“A”字形紙片，置于瓊脂平板中央，然后將平板打
開，放在紫外線燈管下60～80cm處直接照射30分鐘。
3照射完畢，用無菌鑷子將黑紙片取出燒掉或投入消毒缸內，隨即蓋好皿蓋，37℃培養(yǎng)24
小時，觀察和分析結果。
三化學消毒法(disinfection by chemical factors)
【材料】
大腸桿菌肉湯培養(yǎng)物金黃色葡萄球菌肉湯培養(yǎng)物0.1%新潔爾滅2%紅汞2%龍膽紫生
理鹽水直徑6.5mm的滅菌濾紙圓片普通營養(yǎng)瓊脂平板
【方法】
1首先在瓊脂平板底部標記上述化學消毒劑的名稱，留一對照位置。
2將葡萄球菌與大腸桿菌培養(yǎng)物分別均勻涂布于兩塊瓊脂平板培養(yǎng)基上。
3用滅菌鑷子夾取無菌濾紙片分別蘸取2%紅汞、2%龍膽紫、0.1%新潔爾滅、生理鹽水(對照
)，輕輕貼于瓊脂平板表面勿移動，紙片間的距離約3cm。
4將平板置于37℃溫箱培養(yǎng)24小時后觀察結果。紙片周圍無細菌生長的區(qū)域，稱為抑菌環(huán)
。通過比較消毒劑的濃度與抑菌環(huán)直徑的大小，即可了解化學消毒劑的殺菌作用。
【思考題】
①高壓蒸汽滅菌法、紫外線、青霉素、碘酒的殺菌機理各是什么?
②影響化學消毒劑抑菌殺菌的因素有哪些?
③啤酒、飲料常用什么方法消毒?
④為什么說消毒與滅菌是微生物學和臨床醫(yī)學必不可少的基本知識?
三細菌的分離與培養(yǎng)
Isolation And Culturing of Bacteria
【實驗目的】
1掌握無菌操作技術。
2掌握病原菌的分離與培養(yǎng)方法。
【實驗原理】
細菌學檢驗所接觸的標本，均來自臨床病人，大多數(shù)是含有病原菌而具有傳染性的材料。如
果操作和處理不當，可導致實驗室感染和醫(yī)院內感染。為此，細菌學檢驗，特別是細菌培養(yǎng)
必須隨時為防止污染和病原菌的擴散而進行操作，為達此目的的技術就是無菌操作。
細菌的接種技術主要有：平板劃線分離法，斜面、液體或半固體培養(yǎng)基接種法。為避免在接
種過程中污染環(huán)境和空氣中的細菌污染培養(yǎng)物，細菌接種一般應在超凈工作臺或無菌室內進
行。鑒于學生實驗室的實際條件，要求學生在酒精燈旁進行細菌接種。
細菌的培養(yǎng)技術可分為：
(1)一般培養(yǎng)法即需氧培養(yǎng)法，將已接種好的培養(yǎng)基置于37℃恒
溫箱中培養(yǎng)18～24小時，一般細菌即可在培養(yǎng)基中生長繁殖。
(2)CO2培養(yǎng)法某些細菌，如腦膜炎球菌、布氏桿菌等，需在增
加CO2的環(huán)境中培養(yǎng)才能生長良好，可采用CO2孵箱培養(yǎng)法、燭缸法、化學法。
(3)厭氧培養(yǎng)法(見綜合性實驗二·厭氧菌的檢驗一節(jié))
。
人工培養(yǎng)細菌在醫(yī)學中的實際應用主要有四個方面：
(1)細菌的鑒定和研究細菌的人工培養(yǎng)是鑒定細菌種屬的基本手段。觀察細菌的形態(tài)，了
解各種細菌的培養(yǎng)特性、代謝活動、生化反應、抗原結構、致病力等，均須首先培養(yǎng)純種細
菌，使其繁殖到足夠的數(shù)量。
(2)感染性疾病的診斷和防治由細菌所引起的感染性疾病，最確切最可靠的診斷依據(jù)(金標
準)
是用人工培養(yǎng)法，從病人材料中把病原菌分離培養(yǎng)出來，并鑒定其種型。為選擇有效的抗菌
藥物對病人進行合理治療，也必須通過人工培養(yǎng)方法，將從病人檢出的病原菌進行藥物敏感
試驗。
(3)生物制品的制備供某些傳染病血清學診斷使用的細菌診斷液、供預防接種用的活菌或
死菌菌苗和類毒素、供治療使用的免疫血清或抗毒素血清或微生態(tài)制劑等生物制品，在其制
備過程中均須進行細菌的人工培養(yǎng)。
(4)菌種的保存從不同來源分離培養(yǎng)的菌株，以及實驗室常備的標準菌株，常需保存較長
時間以備應用。
【實驗內容和方法】
一細菌分離培養(yǎng)法(isolation of pure culture)
細菌在自然界分布甚廣，種類繁多，被檢的臨床標本常含有多種細菌，如果要證明該標本中
是否存在某種細菌，或專門研究其中一種細菌等，必須進行細菌分離與純化，獲得純種培養(yǎng)
物。
通常采用平板劃線法從臨床標本中分離出病原菌，即：借助劃線而將混雜的細菌在瓊脂平板
上分散開來，使單個細菌能固定在一點，在適宜的溫度下生長繁殖后，各自形成肉眼可見的
細菌集團——單菌落，進而根據(jù)菌落形態(tài)特征，將單菌落移植傳代后進行大量增殖所得的菌
種，稱為純種微生物(純培養(yǎng))。
常用接種工具可分為接種針和接種環(huán)兩類。接種環(huán)用來挑取標本菌液及劃菌落涂平板等。接
種針則用來挑取單個菌落，穿刺培養(yǎng)等。用于制作接種針或接種環(huán)的金屬絲通常用鎳鉻絲或
鉑絲做成，具有紅得快、冷得迅速、能經受反復燒灼、不易氧化、無毒性，且軟硬適中等特
性。
【材料】
膿汁標本糞便標本普通營養(yǎng)瓊脂平板伊紅美藍瓊脂平板接種環(huán)酒精燈
【方法】
1右手拿接種環(huán)(如握筆式)，燒灼滅菌，欲伸入試管內的接種環(huán)桿部分亦要迅速通過火焰2
～3次，以殺滅其表面的細菌。
2左手握住盛有標本的試管的下端，右手以無名指、小指與手掌在火焰旁拔出試管棉塞并
挾住之，將管口迅速通過火焰三次滅菌。
3立即將已滅菌冷卻的接種環(huán)伸入試管內，沾取標本(或菌液)一環(huán)。試管口火焰滅菌后塞
好棉塞(無菌取材操作見圖2)。
圖2無菌取材的基本步驟
4左手斜持平板，略開蓋，在酒精燈火焰左前方約5～6cm處，將接種環(huán)上的菌液涂抹
于平板表面的邊緣部分。
5燒灼接種環(huán)，冷卻后，將接種環(huán)自涂抹部分沾取少許菌液，使接種環(huán)與平板
表面成30～4
0°角，用腕力將接種環(huán)在平板表面來回輕快地劃線，動作要輕巧，劃線要密但不能重疊，
充分利用平板的面積。
圖3平板曲線劃線分離法
以上為曲線劃線分離法(見圖3)，多用于接種材料中含菌數(shù)量相對較少的標本或培養(yǎng)物
。而
分區(qū)劃線分離法(見圖4)多用于糞便等含菌量較多的標本，方法是：從原涂抹部分開始，連
續(xù)平行劃線，每次只劃平板的1/4～1/5，劃畢后接種環(huán)再經火焰滅菌，冷卻后用同樣方法在
平板其余部分劃線，每次劃線要與前次劃線重疊1～3條，共計3～4次(區(qū))。
6接種完畢，將接種環(huán)燒灼滅菌后方可放下。
7將培養(yǎng)皿倒置(瓊脂平板的底部向上)，37℃培養(yǎng)24小時后，觀察結果。
圖4平板分區(qū)劃分離法
圖5瓊脂斜面接種的
好環(huán)映型
【注意事項】
●每次取菌(或接種)前后，均須燒灼接種工具，接種完畢，不能直接將接種環(huán)在火焰中燒灼
，以免環(huán)上的細菌或標本因受高熱爆烈四濺，應先將細菌或標本烤干后再燒灼。
●不要劃破瓊脂表面。
●注意無菌操作，防止空氣中微生物掉入平板中造成污染。
●初學者可將平皿蓋打開放在實驗臺上，再行劃線接種。
二斜面培養(yǎng)基接種法(inoculation of slant medium)
用于細菌增殖和菌種傳代、保存。
【方法】(見圖5)
1右手拿接種針(環(huán))，燒灼滅菌(方法同前)，冷卻后，左手拿平板并略打開平皿蓋，通過
無菌操作挑取少許菌苔或一個單菌落。
2左手迅速放下平板，握住一個斜面培養(yǎng)基管的下端(斜面部應向上，勿成水平，以免凝固
水浸濕培養(yǎng)基表面)。右手以無名指、小指與手掌在火焰旁拔出斜面培養(yǎng)基管棉塞并挾住之
，將管口迅速通過火焰三次滅菌。
3立即將接種針(環(huán))伸入斜面培養(yǎng)基管內，在瓊脂表面先從底部向上行拉一線，然后自下
而上輕輕地作蜿蜒連續(xù)劃線，勿觸破培養(yǎng)基表面。
4接種完畢，試管口迅速通過火焰2～3次滅菌，塞好棉塞。接種環(huán)或針燒灼后方可放下。
5斜面培養(yǎng)基管置于37℃培養(yǎng)過夜。
三液體培養(yǎng)基接種法(inoculation of liquid medium)
用于測定細菌生化特性，觀察細菌的不同生長情況。
【方法】
1接種環(huán)接種法：通過無菌操作(方法同前)挑取菌苔少許或菌液一環(huán)，立即移入肉湯培養(yǎng)
基管中，在接近液面的管壁上輕輕研磨，并沾取少量肉湯調和，使菌液混合于培養(yǎng)基中，混
勻。接種完畢，試管口迅速通過火焰2～3次滅菌，塞好棉塞。接種環(huán)燒灼后方可放下。
2移液管或滴管接種法：先擰斷移液管或滴管大口端的包扎紙，套上吸球抽出移液管，
并且不要觸及其他物體以防污染。左手拿菌種管，右手的拇指和食指夾住移液管和吸球，用
小指和掌邊拔出試管棉塞，將移液管或滴管伸入菌種管中，
吸取菌液后立即接種至肉湯培養(yǎng)基管或三角燒瓶中，然后管口火焰滅菌塞上棉塞，
充分搖動幾下使菌液與培養(yǎng)基混勻
。帶菌的移液管或滴管應浸入5%石炭酸缸中，至少浸30分鐘。
四半固體培養(yǎng)基接種法(穿刺接種法)(inoculation of semisolidmedium)
用于細菌動力試驗，即觀察細菌有無運動能力。
圖6半固體培養(yǎng)基穿剌
接種法
【方法】(見圖6)
1如斜面培養(yǎng)基接種法握持菌種管及待接種的半固體瓊脂培養(yǎng)基。
2右手握接種針，滅菌冷卻后，挑取菌苔少許，垂直刺入半固體瓊脂培養(yǎng)基的中心，可刺
達近管底處，但不要達于管底，然后沿原路退出。
3接種完畢，試管口迅速通過火焰2～3次滅菌，塞好棉塞。接種針燒灼后方可放下。
4斜面培養(yǎng)基管置于37℃培養(yǎng)過夜。
【思考題】
①做細菌培養(yǎng)時，平板為什么要倒放?
②培養(yǎng)細菌的常用方法有哪些?
③從臨床標本中分離病原菌，應注意哪些事項?
④為什么接種環(huán)在使用前、后都必須燒灼滅菌?忽略了有什么危害?
⑤半固體穿刺接種時，為什么要強調“原路返回”?
四細菌群體生長特征的觀察
Observation of Growth Characteristics of BacterialPopulation
【實驗目的】
了解并比較細菌在固體、半固體及液體培養(yǎng)基上的生長特征。
【實驗原理】
不同的細菌生長在一定的培養(yǎng)基上往往有不同的特征，因此，培養(yǎng)特征可以作為細菌分類鑒
定的重要依據(jù)。
【實驗內容】
一觀察細菌在固體培養(yǎng)基上生長特征
1平板菌落特征
細菌在瓊脂平板上培養(yǎng)一定時間后，形成菌落。各種細菌菌落都有一定的特點，表現(xiàn)在以下
幾方面：
①大�。捍�(直徑約3mm以上)，中(直徑約1～3mm)，小(直徑約1mm以下)。
②形狀：圓形，卵圓形、假根形、絲狀、不規(guī)則等。
③邊緣：整齊，鋸齒狀，波浪狀，羽毛狀。
④表面：隆起、平坦、中心凸起、臍形凹陷；光滑或粗糙、濕潤或干燥。
⑤溶血性：不溶血，不完全溶血(菌落周圍呈草綠色、不透明)，溶血(菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán))
。
⑥色素：一般為無色或灰白色，特殊色素有兩類：脂溶性色素(菌落本身著色，培養(yǎng)基不著
色)和水溶性色素(菌落及培養(yǎng)基均著色)。
2斜面菌苔的特征
不同的細菌在斜面培養(yǎng)基上生長，往往也具有一定的特征，表現(xiàn)在生長量、菌苔形狀(如線
狀、念珠狀、假根狀、薄膜狀等)、表面形狀、光澤、透明度、顏色等方面。
二細菌在液體培養(yǎng)基中生長特征的觀察
細菌在液體培養(yǎng)基中生長可出現(xiàn)肉眼可見的各種特征，如培養(yǎng)液渾濁或澄清，出現(xiàn)形態(tài)不一
(如絮狀、塊狀等)的沉淀，或在培養(yǎng)基表面形成菌膜(薄膜、厚膜或僅沿管壁產生一圈菌
膜即菌環(huán)等)。
三細菌在半固體培養(yǎng)基上生長特征的觀察
不同的細菌經半固體培養(yǎng)基穿刺接種后生長情況不同。能運動的細菌，往往沿穿刺線擴散生
長
(即有動力)，而使穿刺線周圍出現(xiàn)模糊或混濁；不能運動的細菌僅沿穿刺線生長；嚴格好氧
菌僅表面生長，兼性厭氧菌沿整個穿刺線生長。
五細菌個體形態(tài)特征的觀察
Observation of Morphologic Characteristics of Bacteria
【實驗目的】
1掌握油鏡的正確使用。
2掌握細菌涂片標本的制備。
3掌握革蘭氏染色法。
4熟悉細菌的基本形態(tài)。
5了解細菌的特殊結構。
【實驗原理】
細菌是一類具有細胞壁的單細胞微生物，在一定環(huán)境下有相對恒定的形態(tài)結構。盡管細菌菌
落肉眼可見，但要觀察單個細菌細胞，必須借助光學顯微鏡將其放大900～1000倍，因此，
掌握顯微鏡的使用方法是研究細菌的基本技能。在微生物學中主要使用的是油鏡。油鏡是因
為在使用時需要香柏油作介質而得名。
細菌菌體在強光下呈透明或半透明，其折光系數(shù)與玻璃片相似，在光學顯微鏡下難以看清楚
，所以，必須將細菌制成涂片，固定后，用化學染料使菌體著色，從而和周圍背景產生鮮明
對比，才能觀察到細菌的形態(tài)與結構。
染色方法有單染法和復染法。單染法是只用一種染料染色，如美藍或復紅，能清楚觀察菌體
大小、形態(tài)與排列，但不能鑒別細菌。復染法，即鑒別染色法，是用兩種或兩種以上染料，
可將細菌染成不同的顏色，用于協(xié)助鑒別細菌。常用的復染法有革蘭氏染色法和抗酸染色法
。
革蘭氏染色法是細菌學中最為經典的、廣泛應用的染色法，可將細菌分成兩大類：革蘭氏陽
性(G+)菌和革蘭氏陰性(G-)菌。
革蘭氏染色法的原理尚不完全清楚，主要有三種學說：
(1)通透性學說：G+菌細胞壁結構比較致密，肽聚糖層厚，脂質
含量少，酒精不易透入，反
而可使細胞壁脫水而形成一道屏障，阻止染料向細胞外滲。G-菌細胞壁比較疏松，肽聚糖
層
很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂質，易被酒精溶解，致使細胞壁通透性增高，
細胞內的結晶紫—碘復合物容易被酒精脫出。
(2)等電學說：G+菌等電點(pH2～3)比G-菌(pH4～5)低，一般
染色時染液的酸堿度在pH7.0左
右，電離后陽性菌帶的負電荷比陰性菌多，因此與帶正電荷的結晶紫染料結合牢固，不易脫
色。
(3)化學學說：G+菌細胞內含有某種特殊化學成分，一般認為是
核
糖核酸鎂鹽與多糖的復合物，它與染料—媒染劑復合物結合，使已著色的細菌不易脫色。
革蘭氏染色法的實際意義有鑒別細菌、指導臨床上選用有效藥物和了解細菌的致病
機理。在細菌分離培養(yǎng)或細菌藥敏試驗來不及做的情況下，�？筛鶕�(jù)細菌涂片染色鏡檢的初
步結果來選擇用藥，有利于及早控制感染。
【實驗內容和方法】
一油鏡的使用和保護(use and care of oilimmersionmicroscope)
1將顯微鏡平置于實驗臺上。
2轉動物鏡轉換器使低倍鏡與鏡筒垂直到位(聽到“咔”聲即可)。然后將反光鏡凹面對著
日光燈源翻動，打開聚光器的光圈，將聚光器升至最高，側面觀察聚光器明亮或從目鏡觀察
視野明亮即說明對光完成。
3將標本(標本面向上)放入載物臺上的標本夾中，先用低倍鏡找出標本的范圍。
4在鏡頭對準的玻片部位滴一滴香柏油，轉換油鏡(鏡頭刻有一個“HI”或“oil”字或標
有100×)，眼睛從鏡筒側面看油鏡頭，將粗調節(jié)器作順時針或逆時針方向(取決于不同
型號的顯微鏡)緩緩轉動使鏡筒下降，并使油鏡頭浸泡于油中，幾乎與標本接觸。然后用左
眼看目鏡，一面觀察，一面仔細調節(jié)微調節(jié)器使鏡頭提升，直到物像清楚為止。
5油鏡用畢，應立即以擦鏡紙拭去香柏油，然后再用擦鏡紙沾少許二甲苯擦拭，最后用干
凈擦鏡紙擦去二甲苯。將各物鏡轉成“八”字形，聚光器稍下降，以免接物鏡與聚光鏡相碰
受損，然后放入鏡箱。
【注意事項】
●取送顯微鏡時動作要輕，一只手持鏡臂，一只手托鏡座，防止反光鏡、目鏡、物鏡等脫落
損壞。
●勿將鏡臂彎曲，因為微生物學實驗經常使用油鏡，若載物臺傾斜，鏡油易流淌外溢，
影響觀察或造成污染。
●使用油鏡時，一定要等標本干后才能滴加香柏油，滴油時應避免氣泡形成。
●調焦時要特別謹慎，切忌采用眼睛對著目鏡邊觀察邊下降鏡筒的錯誤操作，以免物鏡與玻
片相撞，損壞鏡頭和壓破標本。
●油鏡用完后一定要擦洗，以防油干影響其使用壽命。
附錄
使用油鏡時，須加香柏油的原理(見圖7)是：油鏡的透鏡孔很小，自標本玻片透過的光線，
圖7油浸鏡使用的原
理
因介質密度(從載物玻片至空氣再進入油鏡)不同，有些光線因折射或全反射 ，就不能進入
透鏡，致使射入的光線較少，物象顯現(xiàn)不清，若在油鏡與載物玻片中間加入和玻璃折射率(n
=1.52)相仿的香柏油(n=1.515)，則不使通過的光線有所損失，進入透鏡的光線即多，視野
的亮度也就增大了。
二細菌涂片(Smear)標本的制備
細菌是膠體性物體，染色鏡檢時，必須經過輕烤脫水使菌體固定在玻片上。固定的目的是：
①殺死細菌；②使菌體不易變形；③使菌體與玻片粘附較牢，在染色時不致被染液和水洗掉
；④使菌體蛋白變性易著色。
【材料】
膿汁標本分離菌糞便標本分離菌酒精燈接種環(huán)載玻片生理鹽水
圖8細菌涂片的制作
【方法】(見圖8)
1涂片：取潔凈的載玻片一張，用在火焰上燒過的接種環(huán)取生理鹽水1～2環(huán)于玻片上。接
種環(huán)滅菌后，挑取細菌培養(yǎng)物少許與鹽水輕輕磨勻，涂抹成直徑1厘米大小的均勻薄膜。臨
床標本如膿汁、痰、分泌物等可直接涂片。
2干燥：涂片最好在室溫中自然干燥，必要時可將涂片膜面向上，小心間斷地在弱火高處
略烘，以助水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰，以免涂膜烤枯，染色后難以檢查。
3固定：手持玻片的一端，標本面朝上，在火焰外層快速地來回通過2～3次，共約2～3秒
，使標本固定，即可進行染色。
【注意事項】
●涂片不可過厚，一定要涂成薄膜。
●涂片必須注意輕輕操作，如果動作過猛，可能會產生氣溶膠，造成飛沫傳染。
●固定要適當，溫度不宜過高，否則可能使細胞形態(tài)改變。
三革蘭氏染色法(Gram′s stain)
【材料】
結晶紫染液(第1液)蘆戈氏碘液(第2液)95%酒精(第3液)稀釋石炭酸復紅(第4液)染
色架吸水紙
【方法】
1初染：在已固定的細菌涂片上滴加結晶紫染液1～2滴，經1分鐘后用細流水緩緩沖洗，并
傾去玻片上余水。
2媒染：加蘆戈氏碘液1～2滴，經1分鐘后用細流水緩緩沖洗，并傾去玻片上余水。媒染劑
的作用是增加染料和細胞之間的親和性或附著力，不易脫落。
3脫色：滴加95%酒精數(shù)滴，輕輕搖動玻片幾秒鐘，使均勻脫色，然后斜持玻片，使脫掉的
染料隨酒精流去，再滴加酒精，直到流下的酒精無色或稍淡紫色為止(約需20～30秒)，立即
用細流水將酒精沖掉，并傾去玻片上余水。
4復染：加稀釋復紅1～2滴，經30秒～1分鐘后用細流水緩緩沖洗，并傾去玻片上余水。
標本涼干后，滴加香柏油，用油鏡觀察，革蘭氏陽性菌染成紫色，革蘭氏陰性菌染成紅色。
【注意事項】
●革蘭氏染色時，關鍵環(huán)節(jié)是脫色。若脫色不夠，革蘭氏陰性菌可被染成陽性菌；脫色過度
，革蘭氏陽性菌可被脫色而誤認為是革蘭氏陰性菌。
四細菌的基本形態(tài)與特殊結構的觀察
【材料】
1.球菌示教片：葡萄球菌淋球菌
2.桿菌示教片：大腸桿菌痢疾桿菌
3.螺菌示教片：幽門螺桿菌霍亂弧菌
4.特殊結構示教片：鞭毛(傷寒桿菌)芽胞(破傷風桿菌)莢膜(肺炎鏈球菌)
【思考題】
①如何使用油鏡?
②革蘭氏染色法的關鍵步驟是什么?為什么?
③染色時為什么通常要用新鮮的細菌培養(yǎng)物?
六細菌生化反應鑒定
Characterization of Bacteria by Biochemical Reaction
【實驗目的】
1熟悉幾種常用的細菌生化反應的名稱、原理、方法、結果分析及用途。
2掌握血漿凝固酶試驗的原理、方法及用途。
【實驗原理】
由于細菌的種類和基因結構不同，所形成的獨特酶系也不同，故對糖和蛋白質的分解能力及
其代謝產物亦不一，能表現(xiàn)各自的特點。據(jù)此采用生化反應檢測細菌對各種基質的代謝作用
及其代謝產物(分解代謝和合成代謝產物)，不僅可以區(qū)別和鑒定細菌的種類，而且可以探討
細菌的生活規(guī)律、代謝機理及其與周圍環(huán)境物質之間的關系。
不同細菌分解糖類的能力不同，分解產物也不一樣。有的細菌能分解某些糖類而產生多種酸
(如乳酸、醋酸等)和氣體(如H2、CO2等)，有的只產酸不產氣。有的細菌不能分解某些
糖。某些細
菌能分解蛋白質中的胱氨酸等含巰基氨基酸，形成硫化氫。硫化氫遇醋酸鉛或硫酸亞鐵則形
成黑褐色的硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。借此可協(xié)助鑒別菌種。
細菌在生長繁殖過程中，還能產生一些具有鑒別意義的酶，如：
(1)幽門螺桿菌能在胃中(酸性環(huán)境)定植和生長，其中一個重要原因是該菌產生大量的尿素
酶，分解尿素釋放出氨，從而緩沖酸性pH的作用，造成一個局部的中性微環(huán)境。
(2)致病性葡萄球菌能產生血漿凝固酶，能使含有枸櫞酸鈉或肝素抗凝劑的人或兔等動物血
漿發(fā)生凝固，凝固的血漿沉積于菌體表面，阻礙吞噬細胞的吞噬，或即使被吞噬，也不易被
殺死，從而有利于細菌繁殖，引起感染。在臨床微生物學檢查中，血漿凝固酶是鑒別葡萄球
菌有無致病性的重要指標。
【實驗內容和方法】
1糖發(fā)酵試驗(sugar fermentation test)
單糖發(fā)酵微量管是只含有一種糖(如葡萄糖、乳糖)的pH7.6的蛋白胨水，并加入一定量的指
示劑。接種細菌經培養(yǎng)后，若該菌具有分解該糖的酶，有酸產生時就能使指示劑變色。如指
示劑為酸性復紅［pH4.2(紅色)～6.2(黃色)］，則變成紅色；溴甲酚紫［pH5.2(黃色)～6.8
(紫色)］則呈黃色。若有氣體產生，則微量管內集聚氣泡。
【材料】
糞便標本分離菌接種針小砂輪葡萄糖發(fā)酵微量管(管底紅色)乳糖發(fā)酵微量管(管底
黃色)
【方法】
1通過無菌操作，用滅菌接種針刮取細菌新鮮培養(yǎng)物少許，分別接種在葡萄糖發(fā)酵微
量管和乳糖發(fā)酵微量管內。
2將微量管平放在平皿蓋內，37℃培養(yǎng)過夜后觀察結果。
3結果判斷：如培養(yǎng)基中指示劑顏色未變時，表明細菌不分解糖，以“-”表示。如顏色改
變時為細菌分解糖產酸，以“+”表示；如果同時有氣泡產生時，則為細菌分解糖產酸又產
氣，以“”表示。
【注意事項】
●觀察結果時，應先觀察是否產氣，切勿將微量管豎立，以免氣體溢出。
二甘露醇發(fā)酵試驗(mannitol fermentation test)
【材料】
膿汁標本分離菌甘露醇微量管
【方法】
1通過無菌操作，用滅菌接種針挑取細菌新鮮培養(yǎng)物少許，接種在甘露醇微量管內。
237℃培養(yǎng)過夜后觀察結果。
3結果判斷：培養(yǎng)基中指示劑顏色改變時為細菌分解甘露醇產酸，以“+”表示，不變?yōu)殛?/p>
性反應。
三硫化氫試驗(hydrogen sulfide test)
【材料】
糞便標本分離菌硫化氫微量管
【方法】
1通過無菌操作，用滅菌接種針挑取細菌新鮮培養(yǎng)物少許，接種在醋酸鉛微量管內。
237℃培養(yǎng)過夜后觀察結果。
結果判斷：醋酸鉛培養(yǎng)基中出現(xiàn)黑色沉淀為陽性反應，不變?yōu)殛幮苑磻?/p>
四尿素分解試驗(ureasplitting test)
細菌產生的尿素酶能分解尿素形成大量的氨，使培養(yǎng)基酸堿度上升而變成堿性，酚紅指
示劑呈現(xiàn)紅色，是為陽性反應。
【材料】
糞便標本分離菌尿素微量管
【方法】
1通過無菌操作，用滅菌接種針挑取細菌新鮮培養(yǎng)物少許，接種在尿素微量管內。
237℃培養(yǎng)過夜后觀察結果。
3結果判斷：尿素培養(yǎng)基從黃色變?yōu)榧t色者為陽性反應，不變?yōu)殛幮苑磻?/p>
五血漿凝固酶試驗(coagulase test)
【材料】
膿汁標本分離菌兔血漿生理鹽水載玻片
【方法】
1取干凈玻片一塊，用計號筆將玻片分為兩格，其中一格加兔血漿1～2滴，另一格加生理
鹽水1滴。
2將接種環(huán)在酒精燈火焰上燒灼滅菌冷卻后，取細菌新鮮培養(yǎng)物少許，在生理鹽水中研磨
混勻成細菌懸液。
3用滅菌接種環(huán)取細菌懸液1環(huán)，或挑取細菌培養(yǎng)物少許，在兔血漿中輕輕磨勻。
4稍待片刻，觀察結果。
5結果判斷：先觀察生理鹽水對照，應呈均勻混濁現(xiàn)象。再觀察細菌與兔血漿混合物，
若有凝塊出現(xiàn)，則為陽性；無凝塊出現(xiàn)為陰性。
【注意事項】
●兔血漿和細菌培養(yǎng)物要適量，以免干燥，難以觀察結果。
【思考題】
①細菌生化反應在感染性疾病診斷中有何重要意義?為什么?
②分析本次實驗的結果。如結果不佳，原因何在?
③為保證實驗結果的可靠性，你認為上述試驗應還設立哪些對照?
七細菌血清學反應鑒定
Characterization of Bacteria by Serological Reaction
【實驗目的】
1掌握玻片凝集試驗的原理、方法、結果觀察與判斷。
2熟悉肥達氏反應的原理、方法、結果判斷和分析。
【實驗原理】
血清學反應是指抗原抗體www.med126.com在體外的特異性結合反應，可用已知抗原檢測未知抗體或用已知抗
體檢測未知抗原。常見的有凝集反應、沉淀反應、補體結合反應和中和反應等。血清學反應
常用于傳染病的診斷和微生物菌株的鑒定。
將已知的抗體(診斷血清)直接與未知的顆粒性抗原物質(如細菌)混合，在有適當電解質存在
條件下，如兩者對應便發(fā)生特異性結合而形成肉眼可見的凝集物，即為陽性；如兩者不對應
便無凝集物出現(xiàn)，即為陰性，稱為直接凝集反應，屬定性試驗，有玻片法和試管法兩種，主
要用于檢測抗原，如菌種的鑒定與分型、ABO血型鑒定等。
用各種標準的傷寒桿菌H、O抗原和甲型副傷寒H抗原、乙型副傷寒桿菌H抗原與病人不同稀釋
倍數(shù)的血清做定量凝集試驗，稱為肥達氏反應，可用于測定患者血清中相應抗體的含量及其
增減情況，以輔助腸熱癥(傷寒和副傷寒)的診斷。
【實驗內容和方法】
一玻片凝集試驗(slide agglutination test)
【材料】
載玻片診斷血清糞便標本分離菌
【方法】
1取干凈載玻片二張，用計號筆將玻片分為兩格，分別加入大腸桿菌診斷血清、痢疾桿菌
診斷血清、傷寒桿菌診斷血清、乙型副傷寒桿菌診斷血清各1～2滴。
2將接種環(huán)燒灼滅菌、冷卻后，取細菌培養(yǎng)物少許，分別在4種診斷血清中研磨混勻，接
種環(huán)作滅菌處理后方可放下。
3如上述混合懸液由均勻混濁變?yōu)槌吻逋该�，并出現(xiàn)大小不等的乳白色凝集塊者即為陽性
；如混合物仍呈均勻混濁則為陰性。如肉眼觀察不夠清楚，可將玻片置于顯微鏡下用低倍鏡
觀察。一般可立即出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，如結果不明顯，可轉動玻片數(shù)次。2～3分鐘仍不出現(xiàn)凝集
者，可認為陰性。
4觀察完畢，將載玻片立即放入指定的消毒缸內(為什么?)
【注意事項】
●診斷血清和細菌培養(yǎng)物比例要適量，以免干燥，來不及觀察結果。
●每一菌株應同時作生理鹽水對照，防止誤將細菌自凝現(xiàn)象認為凝集反應。
二肥達氏反應(widal test)
【材料】
病人血清甲型副傷寒桿菌“H”菌液乙型副傷寒桿菌“H”菌液傷寒桿菌“H”菌液與
“O”菌液試管吸管吸頭生理鹽水37℃水浴箱
【方法】
1取小試管28支，在試管架上排成4排，每排7支。
2在中試管加入生理鹽水3.8ml，再換一支吸管，吸取患者血清(須先經56℃，30分鐘滅活)
0.2ml，并用原吸管吸吹3次混勻(這時血清稀釋度為1∶20)。
3取1∶20血清2ml，在每排第1管中各加入0.5ml。
4吸生理鹽水2ml，加入到上述中試管中，與余下的2ml1∶20的血清混勻，即稀釋成1∶40
。然后吸取2ml1∶40的血清，向每排第2管中各加入0.5ml。
5按上法將血清不斷做倍比稀釋，并依次加入各管，直至每排第6管止。
6各排第7管不加血清，各加入生理鹽水0.5ml作為對照。
7依7、6、5……1管的順序，加入菌液：
第1排各管中加入傷寒桿菌“H”菌液0.5ml。
第2排各管中加入傷寒桿菌“O”菌液0.5ml。
第3排各管中加入甲型副傷寒桿菌“H”菌液0.5ml。
第4排各管中加入乙型副傷寒桿菌“H”菌液0.5ml。
這時每排各管中血清的最終稀釋度如下：
試管序號〖〗1〖〗2〖〗3〖
〗4〖〗5〖〗6〖〗7
血清稀釋度〖〗1∶40〖〗1∶80〖〗1∶160〖〗1∶320〖〗1∶640〖〗1∶1280〖〗——
8將各管中懸液混勻，置37℃水浴箱中2小時，取出置室溫過夜，次日觀察結果。
附：結果判斷與分析
先看各排對照管，應無凝集，懸液仍然均勻混濁，或僅有極少量菌體沉于管底呈一集中的小
點；傷寒桿菌“H”抗原、甲型和乙型副傷寒桿菌“H”抗原與相應抗體的凝集塊呈絮狀疏松
，沉于管底，輕搖時沉淀物極易浮起，且易破碎；傷寒桿菌“O”抗原的凝集較緊密，呈顆
粒狀沉于管底。
根據(jù)凝集反應的強弱，分別以、、、＋記錄之。
：液體清徹透明，菌體全部被凝成塊，沉于管底。
：液體較透明，菌體大部分被凝集而沉于管底。
：液體稍透明，管底有少量凝集沉淀物。
＋：液體較混濁，可見極少量凝集沉淀物。
-：液體的混濁度及管底沉淀物與對照管相似，無沉淀。
一般以出現(xiàn)凝集的血清最高稀釋倍數(shù)作為該血清對某抗原的凝集效價。
在分析結果時，首先應考慮當?shù)卣Ｈ诵r。一般以單份血清凝集效價：傷寒O應達1∶80以
上、傷寒H應達1∶160以上，甲型和乙型副傷寒H應達1∶80以上才有診斷價值。若第二次血
清效價比第一次高4倍以上，有診斷價值。
【思考題】
1、血漿凝固酶試驗和玻片凝集試驗觀察完畢，應將載玻片立即放入消毒缸內，為什么?
2、根據(jù)實驗結果，試分析標本中可能有何種細菌，為什么?
八細菌藥物敏感性試驗
Test of Susceptibility of Bacteria to Drug
【實驗目的】
1熟悉藥物敏感性試驗方法的種類、原理及應用。
2掌握紙片擴散法。
【實驗原理】
自從抗生素、磺胺類等抗菌藥物廣泛應用以來，致病菌對這些藥物產生耐藥性的情況日益增
多，并以金黃色葡萄球菌、結核桿菌、痢疾桿菌、銅綠色假單胞菌、大腸桿菌等尤為突出。
細菌耐藥性變異，是臨床工作中必須注意的問題。為了防止細菌產生耐藥性和確保治療效果
，在用抗生素治療前，應做細菌藥物敏感性試驗，選用敏感的藥物進行治療，避免為耐藥性
突變的菌株提供選擇和發(fā)展的條件，這就要求細菌學工作者必須保證藥敏試驗結果高度準確
性。
細菌對抗生素敏感性試驗方法有：
(1)液體稀釋法：在試管中加入一定量適于測試菌生長的液體培養(yǎng)基作為稀釋液，將不同劑
量的藥物加入各管中，使形成一組含不同遞減濃度的藥物試管，然后逐管加入一定量的測試
菌，在合適溫度下培養(yǎng)一定時間后，用肉眼觀察其混濁度或用光電比色計作比濁測定，以不
長菌管的最低藥物劑量為該藥的MIC；
(2)瓊脂稀釋法：將不同劑量的藥物與一定量融化的固體培養(yǎng)基相混合，制成含不同遞減濃
度的藥物平板，然后將一定量的測試菌接種于含藥平板上，在合適溫度下培養(yǎng)一定時間后，
觀察測試菌的生長情況，以不長菌的平板所含最低藥物劑量為該藥的MIC；
(3)紙片擴散法：是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基的擴散滲透作用，將含已知濃度的藥物濾紙片
貼于含有敏感性試驗菌的瓊脂培養(yǎng)基表面，抗生素就自紙片向平板四周擴散滲透，在抑菌濃
度所達范圍內敏感菌的生長被抑制而出現(xiàn)抑菌圈，通過比較抗生素濃度與抑菌圈的大小以測
定抗生素的抑菌濃度。
細菌藥敏試驗中所用的專門名詞解釋如下：
最低抑菌濃度(Minimal InhibitoryConcentration,MIC)：抗菌藥
物能夠抑制細菌生長所需要的最低濃度。
最低殺菌濃度(Minimal BacteriacidieConcentration,MBC)：抗
菌藥物殺滅細菌所需要的最低濃度。
敏感(Sensitive)：常用量預期有效。
中度敏感(Moderate sensitive)：常用量體內藥物濃度較高的部
位或超常用量增加血中藥物濃度預期有效。
耐藥(Resistant)：常用量預期無效。
病原菌對某種抗菌藥物敏感、中度敏感和耐藥的分界點是根據(jù)該菌在血中的治療濃度和病原
菌對該藥物的最小抑菌濃度而確定的。
【實驗內容和方法】
一紙片瓊脂擴散法(Kirby Bauer method)
本法快速、簡便，已為多數(shù)臨床細菌學實驗室所采用。
【材料】
膿汁標本病原菌糞便標本病原菌MullerHinton瓊脂平板肉湯培養(yǎng)基青霉素、鏈霉
素、慶大霉素和生理鹽水濾紙片尺
圖9紙片法藥敏試
驗圖型
【方法】
1培養(yǎng)基制備MH瓊脂(pH7.2～7.4)傾注入直徑9cm平皿中，厚
度約為4mm。臨用時，半開
蓋平板，倒置于35℃培養(yǎng)箱10～20分鐘使表面干燥。鏈球菌或其他較難生長的細菌可在上述
培養(yǎng)基中加入5%無菌脫纖維羊血。
2被檢菌液的制備挑取單菌落4～5個，接種于4～5ml肉湯培養(yǎng)
基內，置35℃孵育4～6小
時，使菌液達到或超過1.5×108/ml麥氏比濁管濃度。加入滅菌鹽水，使其濃度與標準管
一致。
3接種制備好的接種菌液必須在15分鐘內使用。用無菌棉拭沾
取新鮮菌液，涂布接種于M
H瓊脂表面，重復三次，每次將平板旋轉60度，保證菌液均勻分布。蓋好平皿，放置5分鐘，
待平板表面水分被瓊脂完全吸收。
4貼抗菌紙片用無菌眼科鑷子夾取抗生素濾紙片(直徑為6.35mm
，每片吸水量約為20μl)
，分別貼在平板上。用鑷尖壓一下，使其貼平。各濾紙片之間距離應基本相等(不少于24cm)
，紙片中心距平皿邊緣約15mm。在平板底面上做好標記。在15分鐘內將平板置35℃培養(yǎng)18～
24小時后取出觀察結果。
5結果判斷如細菌對藥物敏感，則含該藥物的濾紙片周圍無菌
生長。無菌生長的區(qū)域稱
抑菌環(huán)。如細菌對該藥物具有耐性，則無抑菌環(huán)或抑菌環(huán)直徑較小。記錄并比較抑菌環(huán)直徑
大小，判斷細菌的敏感性。
6同時接種質(量)控(制)菌株作為陽性對照。KB法質控用菌株常規(guī)有三種，分別是金黃
色葡萄球菌ATCC25923、大腸桿菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853。生理鹽水紙片作為
陰性對照。
常用藥敏試驗紙片判斷標準
抗菌藥物〖〗紙片含藥量〖〗抑菌圈直徑(mm)〖〗耐藥中度敏感敏
感
青霉素G(葡萄球菌)〖〗10單位〖〗≤28〖〗-〖〗≥29
鏈霉素〖〗10微克〖〗≤11〖〗12-14〖〗≥15
慶大霉素〖〗10微克〖〗≤12〖〗13-14〖〗≥15
四環(huán)素〖〗30微克〖〗≤14〖〗15-18〖〗≥19
【注意事項】
●購取抗生素濾紙片因產地不同，紙片含藥量也可能不同，因此在判斷結果時應注意參照標
準。
●結果的讀取應首先測量質控菌株的抑菌環(huán)直徑，如在允許范圍內，被檢菌結果才可信。
二瓊脂平板稀釋法(agar dilution method)
瓊脂平板稀釋法藥敏試驗的優(yōu)點：(1)比液體稀釋法重復性好；(2)可同時檢測多種被檢菌；
(3)可發(fā)現(xiàn)混合菌和污染菌；(4)可觀察菌落生長良好與否。因此，WHO推薦此法為細菌藥敏
試驗最佳方法。
【方法】
1制備含不同濃度抗菌藥物營養(yǎng)瓊脂平板，當瓊脂溫度在50℃左右時加入抗菌藥物，溫度
過高，抗菌藥物受破壞，溫度過低則藥物不能混勻。
2接種新鮮菌液。用接種環(huán)接種5～8mm圓形區(qū)，
同時接種被檢菌和已知MIC的標準質控菌株。
335℃培養(yǎng)18～24小時后，以完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為被檢菌的MIC，薄層極微
弱生長或只生長1～2個菌落可忽略。陽性對照(不含抗菌藥物)培養(yǎng)基應出現(xiàn)接近融合生長。
附：藥敏自動化檢測系統(tǒng)
目前有MIC2000，MS2，Cobas Bact和Vitek AMS等。這些儀器基本原理是利用光學手段
監(jiān)測細菌增殖的程度。以只含菌不含藥的小管(或小凹)內的光學濁度(或透明度)的增長程度
與含藥和細菌的小管(或小凹)內的細菌增殖程度，對比判斷敏感(S)、中度敏感(MS)或耐藥(
R)。
一般而言，自動化檢測儀主要優(yōu)點是可快速(約4～5小時)獲得藥敏結果，且可同時測十
多種抗菌藥物，臨床醫(yī)師可及時選用有效治療藥物，縮短住院日期，降低醫(yī)藥費用。但不論
哪種自動化檢測儀均不能完全代替WHO推薦的藥敏試驗方法。Vitek AMS與KB擴散法的符合
率95～98%，CobasBact與KB擴散法符合率88.1～90.1%。特別值得注意的是，自動化檢測
儀
不能檢出某些異型耐藥菌株，有時誤將耐藥報告為敏感。AMS也不能發(fā)現(xiàn)污染菌株，可能將
敏感報成耐藥。而KB法可察覺異型耐藥菌株和污染菌株。AMS可避免擴散慢的藥物如SXT藥
敏試驗結果出現(xiàn)假耐藥，而KB法則不能避免。
【思考題】
1、抗生素敏感性實驗有何實際意義?
2、報告紙片法試驗結果，是否符合你所鑒定的細菌的藥敏特性?
3、細菌藥物敏感試驗要設立哪些對照?為什么要設立這些對照?
九.細菌的動物感染與致病性試驗
Animal Infection And Pathogenicity Tests of Bacteria
【實驗目的】
1掌握細菌動物感染的常用方法。
2了解感染動物的細菌學檢查原則。
3了解細菌外毒素和內毒素測定的原理和方法。
【實驗原理】
為了證明人類的某特定感染性疾病是由特定病原菌引起的，必須采取Koch準則的所有步驟，
即：
①在同一特定疾病的機體中常能發(fā)現(xiàn)同一種病原菌；
②能從患病機體中分離出這種病原菌，并獲得純培養(yǎng)；
③將這種培養(yǎng)物接種到易感動物體，應能引起相同的疾��；
④能從感染的實驗動物中重新分離出與原接種菌相同的病原菌，并獲得純培養(yǎng)。
這或許需要在人身上進行某些不合道德的、而又迫不得已的科學實驗。但是，并不是在所有
情形下都有可能采取這些步驟，如不宜在人體中做鼠疫桿菌感染實驗。因此，通常需要在動
物體中進行微生物感染實驗。
細菌的動物感染應用十分廣泛，如：①細菌的鑒別和診斷；②細菌致病物質和致病機理的研
究；③考察抗菌藥物和生物制品的療效；④制備各種免疫血清及抗毒素。
不同的細菌對動物的易感性不一，感染的途徑也不一，因此，在進行細菌的動物感染時應選
擇易感動物，確定適當?shù)母腥就緩�，嚴格�?zhí)行無菌操作。常用的實驗動物有小鼠、豚鼠、家
兔等。為使動物試驗正確、可靠，必須按實驗要求，選擇動物種、系及體質健康，生長發(fā)育
良好，一定的體重和年齡，具有高度敏感(或易感)性，且飼養(yǎng)管理比較方便的動物。
病原菌突破機體的屏障結構并定居于某組織后，能適應機體生化環(huán)境進行生長繁殖，其中大
多數(shù)細菌能產生毒性酶(如血漿凝固酶、透明質酸酶)，構成細菌的侵襲力，同時合成和釋放
毒素(內毒素和外毒素)，引起宿主的損傷而致病。
【實驗內容和方法】
一動物的實驗感染方法與感染動物的細菌學檢查
(infecting method of experimental animal and bacterial examination ofinfected a
nimal)
根據(jù)病原菌不同，可采用不同的接種法，如腹腔內注射、靜脈內注射、皮下注射、腦內接種
、眼角膜接種、肌肉注射和喂飼接種法等。
【材料】
小白鼠肺炎球菌菌液無菌注射器及針頭碘酒、酒精棉球
【方法】
1、用無菌注射器以無菌操作要求吸取肺炎球菌菌液，吸取量稍多于使用量，注射器內不能
有氣泡，故吸入菌液后應將注射器針頭朝上，在針頭上裹以消毒棉花，使氣泡上升，然后輕
輕推出，避免菌液四濺，特別注意防止眼結膜感染。
2、用右手輕輕拖鼠尾，使其爬行于粗物表面上再以左手拇、食兩指抓緊小白鼠兩耳及其頸
項皮膚，使鼠體被固定在左手掌間，以左手無名指或小指夾住鼠尾及左后腿，然后用碘酒消
毒腹壁皮膚。
3、左手傾斜，使小白鼠頭部稍向下，將預先準備的菌液注入腹腔內，注射時右手持已吸有
菌液的注射器，針尖自小鼠左側腹股溝處刺穿皮膚，使針尖在皮下組織內向前移行約1厘米
左右，然后再輕輕向下刺進腹腔，抽吸注射器，如無回血或尿液，表示針頭未刺入肝、膀胱
等臟器，即可注射。
4、接種完畢，將小白鼠標以記號，置入鼠罐中，并填寫動物實驗記錄卡或標簽，注明試驗
動物名稱、編號、注射材料、部位、劑量以及注射日期，然后將卡片掛在動物容器上。
5、感染動物予以隔離喂養(yǎng)，并逐日觀察，注意有無發(fā)病癥狀，如食欲不振，豎毛，不活潑
等現(xiàn)象，并加以記錄，必要時定期測量體重及體溫，若有致死可能，務必在動物瀕死前及時
殺死，作病原學分離與病原學檢查。
6、實驗動物或患病動物的細菌檢查應根據(jù)病原菌不同，采集不同的標本，如血、尿、糞便
、內臟等。對待檢標本，可進行直接涂片、染色鏡檢，或進行細菌的分離培養(yǎng)與鑒定。
二透明質酸酶實驗(spreading test of hyaluronidase)
透明質酸酶，又稱擴散因子，能溶解機體結締組織中的透明質酸，使組織疏松，通透性增加
，使病菌易在組織中擴散、病灶擴大。
【材料】
家兔碘酒、酒精棉球無菌注射器墨汁(或美蘭)溶血性鏈球菌培養(yǎng)物(或透明質酸酶
溶液)生理鹽水。
【方法】
1取家兔一只，將其背部兩側毛剪去，用碘酒、酒精消毒。
2用注射器吸取0.1ml墨汁(或美蘭)和0.1ml溶血性鏈球菌培養(yǎng)物(或含透明質酸酶600單位
的溶液)，注射一側皮內。
3于另一側背部皮內注射0.1ml墨汁和0.1ml生理鹽水，作為對照。
4注射后1小時后觀察結果，比較兩側墨汁擴散范圍的大小。
三內毒素的致熱實驗(fever action of endotoxin)
內毒素具有多種生物學活性，主要毒性作用有發(fā)熱反應、白細胞反應、休克等。將含內毒素
的細菌培養(yǎng)物注入動物體內，由于內毒素的毒性作用，動物可表現(xiàn)出這些癥狀。
【材料】
家兔內毒素(傷寒桿菌培養(yǎng)濾液)半導體點溫度計無菌注射器碘酒、酒精棉球
【方法】
1注射內毒素前，用半導體測溫計固定測量家兔耳內凹處皮膚體溫，并記錄結果。
2以手指輕彈兔耳，去毛，壓迫耳根部靜脈，使耳外緣部靜脈充血而怒張，然后先用碘酒
，再用酒精消毒，用無菌注射器吸取內毒素0.5ml，注入兔耳靜脈內。
3另取一只家兔，同法注射生理鹽水0.5ml，作為對照。
4注射后，每間隔20分鐘測量一次體溫，直至2小時為止，并記錄結果，觀察是否體溫升
高。
四破傷風外毒素的毒性作用實驗
(toxic action of Tetanus exotoxin)
破傷風桿菌外毒素(痙攣毒素)是一種神經毒素，對腦干神經和脊髓前角神經細胞有高度親和
性，以毒害中樞神經系統(tǒng)為主，有導致肌肉強直性痙攣等一系列表現(xiàn)。
【方法】
1取健康小白鼠二只，將其后腿用碘酒、酒精消毒后，一只經肌肉注射破傷風桿菌培養(yǎng)濾
液(含破傷風外毒素)0.1ml；另一只注射肉湯培養(yǎng)基0.1ml作對照，分別將二只小白鼠放入已
標記好的鼠缸內。
2填寫動物實驗記錄卡片，注明試驗動物名稱、記號、注射材料、部位、劑量以及注射日
期等，然后貼于鼠籠上。
3每隔2小時觀察一次。小白鼠尾巴強直，注射毒素側的下肢麻痹，呈強直性痙攣，隨著時
間的延長，癥狀逐漸加劇，并可見全身肌肉痙攣、角弓反張等現(xiàn)象，1～2日內小白鼠死亡。
對照小白鼠無異常表現(xiàn)。
【思考題】
請設計一個破傷風抗毒素中和作用的實驗方案。
十微生物快速診斷新技術
自1876年Koch創(chuàng)用固體培養(yǎng)法分離培養(yǎng)細菌以來迄今的百余年中，微生物診斷技術的進展大
體可分為三個階段。
第一階段在純培養(yǎng)的概念指導下發(fā)展起來的常規(guī)微生物學診斷技
術，主要包括病原體的顯
微鏡檢查、分離培養(yǎng)、生化反應鑒定、血清學反應鑒定及動物實驗等技術。這些技術所需檢
樣量大，耗用藥品器械多，一般要數(shù)天才能出結果，因而不能滿足臨床診斷和治療的需要。
進入本世紀以來，許多微生物學工作者試圖改變這種狀況，努力向簡單、快速的目標邁進，
取得了一些進展，但始終擺脫不了純培養(yǎng)概念的束縛。
第二階段自本世紀七十年代以來，隨著物理學、化學和免疫學的
發(fā)展而建立起來的分析微
生物學技術及免疫學技術，使微生物學診斷技術擺脫了純培養(yǎng)的概念，打破了常規(guī)微生物學
診斷的舊框框，繞過了繁瑣的純培養(yǎng)操作，直接對標本進行檢測，在幾小時甚至幾十分鐘內
獲得結果，使微生物的快速診斷成為可能，達到對傳染病進行早期診斷、治療效果評價及預
后判斷之目的。分析微生物學技術主要包括，氣相色譜技術、電阻抗測量技術、放射測量技
術和發(fā)光技術等。用于微生物快速診斷的免疫學技術常用的有免疫熒光技術、免疫酶聯(lián)技術
、放射免疫技術和對流免疫電泳技術等。
第三階段近十幾年來，由于分子生物學的發(fā)展而建立起來的用于
檢測病原體核酸和蛋白質
的分子生物學技術，如核酸探針診斷技術及聚合酶鏈反應技術等，使病原體的鑒定不再局限
于其外部形態(tài)結構及生理特性等一般性質的檢驗上，而是站在分子水平的高度，檢測病原體
內部的生物大分子(蛋白質、核酸)結構。這些新技術具有簡便、快速、微量、特異等優(yōu)點，
有著廣闊的應用和發(fā)展前景。
以下就API鑒定系統(tǒng)及分子生物學技術作一簡單介紹：
一API鑒定系統(tǒng)及其在微生物檢驗中的應用
長期以來，我國臨床微生物學實驗室一直沿用100多年前由革蘭、巴斯德、科赫及皮特里等
創(chuàng)造的傳統(tǒng)的細菌學鑒定方法。但在今天看來，傳統(tǒng)的鑒定方法不僅過程繁瑣，費時費力，
且在結果的判斷上易發(fā)生主觀片面，難以進行質量控制。隨著微生物感染類型的改變，新型
病原菌的種、屬不斷增加，因此，臨床上迫切需要建立快速、準確的細菌鑒定方法。
本世紀70年代誕生的微生物數(shù)碼分類鑒定法集數(shù)學、電子、信息及自動分析技術于一體，
可將已知菌科鑒定到屬、群、種和亞種或生物型，以根據(jù)不同來源的臨床標本進行有針對性
的鑒定。該法目前已在世界范圍內廣泛應用，具有標準化、商品化、簡易化、微量化、快速
化和系統(tǒng)化等優(yōu)點。
在眾多的細菌快速鑒定系統(tǒng)(API、Minitek、Enterotube、MicroID)之中，API(AnlyticP
roducts INc)系統(tǒng)是目前世界上應用最廣、種類最多的系統(tǒng)。根據(jù)待鑒定的細菌種類的不同
，以及為滿足快速鑒定藥敏試驗和研究工作的要求，API系統(tǒng)設計了不同的項目與底物組合
，可分為四類：
1快速鑒定系統(tǒng)；
2特定菌屬(群)的鑒定系統(tǒng)；
3ATB(Automatic Testing Bacteriology)系統(tǒng)；
4用于研究細菌對糖的發(fā)酵、氧化和同化能力以及細菌所具有的酶譜。
使用生化反應譜索引時，必須先將生化反應所得陽性或陰性結果轉換成數(shù)碼，并與索引手冊
中數(shù)碼相比較。
編碼的原則是將所有的20(或32)個生化反應，加上接觸酶和3個形態(tài)特征，即是否產生芽胞
、革蘭氏染色和菌體形態(tài)是否球狀，從陽性到陰性的信息濃縮成一組數(shù)字。具體用法是每
三個反應為一組，每組內按其位置，第一位陽性為1，第二位陽性為2，第三位陽性為
4，陰性反應時均為0，每個組內數(shù)之和就可能為0、1、2、3、4、5、6、7。如此可將API系
列試驗條測定，組成一個八位或十位的數(shù)字。其數(shù)值舉例如下：
靛尿葡
基萄
質素糖〖〗甘乳蔗露醇糖糖〖〗麥水木芽楊糖素糖〖〗阿明七拉
伯葉糖膠靈〖〗甘纖甘維二露油糖糖〖〗松棉山三子梨
糖糖醇〖〗鼠海觸李藻糖糖酶〖〗芽革細蘭胞氏形染胞色態(tài)
①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④〖〗①②④
- - +〖〗+ - -〖〗- - -〖〗- + -〖〗- + +〖〗+ - -〖〗- - -〖〗+ + -
〖〗〖〗〖〗〖〗〖〗
〖〗〖〗
4〖〗1〖〗0〖〗2〖〗6〖〗1〖〗0〖〗3
這株菌的數(shù)值編碼為41026103，根據(jù)數(shù)值編碼檢索，即可查出此菌的菌
屬和菌種名稱，該菌為艱難梭菌。
從數(shù)值編碼檢索表中查出哪類群菌屬種名稱，同時根據(jù)鑒定概率(%id)對鑒定的可信度作出
評價：
%id≥99.9最佳的鑒定可信
%id99.0～99.8很好的鑒定
%id90.0～98.9好的鑒定
%id80.0～89.9可接受的鑒定
如果%id過低時，應按補充試驗進一步鑒定。從數(shù)值編碼檢索表中查不出類群，可以考慮以
下可能：①編碼的菌是極不典型的；②概率小，不能接受的鑒定；③可疑的鑒定或新種。
API試劑條由高質量透明塑料制成，便于觀察結果，有20個小管式反應杯，內含干燥生化基
質液，常用的生化反應有五類：
1.發(fā)酵試驗為碳水化合物與酸的分解代謝試驗，反應結果通過pH
值的變化而引起指示劑顏色的改變。
2.同化試驗將待測菌分別培養(yǎng)于含各種基質的培養(yǎng)基中，根據(jù)其
能否利用其中的單一碳水化合物作為碳源而得以生長以幫助鑒定，是一種生長試驗。
3.同化或發(fā)酵抑制試驗為生長抑制試驗，待測菌如遇到對其有毒
的化合物就不能生長或不出現(xiàn)相應的反應，據(jù)此可幫助鑒定。
4.酶試驗為分解某些合成底物的化學反應，如待測菌含有相應的
酶就可分解底物自發(fā)顯色或經添加試劑后顯色。
操作程序分準備、接種、觀察并記錄結果三個階段。
一、準備
1.標本處理必要時使用運送培養(yǎng)基及進行細菌的分離培養(yǎng)等。
2.預試驗如革蘭氏染色、鏡檢等。
3.菌落的選擇挑選可疑致病菌的特征性菌落。
二、接種
1.制備細菌懸液挑取1個或多個菌落按不同要求用蒸餾水或生理鹽水制備細菌懸液。
2.接種的濃度根據(jù)試劑條的要求制備約1.5億/ml的細菌懸液。
3.接種的體積有以下三種要求：(1)試驗名稱下無任何標記的小孔，加入細菌懸液至“半
滿”，小管滿而小杯空。(2)如試驗名稱加有方框，則加菌液至平滿，小管和小杯皆滿。(3)
如試驗名稱下有一條橫線，表示需加液體石蠟，應加菌液至半滿后在小杯內加液體石蠟。
三、觀察及記錄結果
接種后的API試條一般經35～37℃培養(yǎng)18～24小時可觀察結果。觀察方法有三種(見下表)：
1.自發(fā)反應可用肉眼直接觀察顏色變化，多數(shù)試驗屬于此種；
2.需添加試劑的反應有些試驗需添加不同的試劑后方出現(xiàn)顏色變化；
3.熒光反應有些試驗需在紫外燈下觀察熒光現(xiàn)象。
API20A生化反應表
測定〖〗底物〖〗反應/酶〖〗結果陰性〖〗陽性
Ind〖〗色氨酸〖〗吲哚產生〖〗加1滴二甲
苯到石蠟中混和，待2～3分鐘，再加入1滴Ehr試劑。試驗必需浮在二甲苯/石蠟油上。5分鐘
之內讀結果黃色〖〗紅色
Ure〖〗尿素〖〗尿素酶〖〗黃—橙色〖〗紅色
Glu〖〗葡萄糖〖〗〖〗溴甲酚紫
Man〖〗甘露醇
Lac〖〗乳糖
Sac〖〗蔗糖〖〗產酸〖〗紫色〖〗黃綠—黃色
Mal〖〗麥芽糖
Sal〖〗水楊素
Xyl〖〗木糖
Ara〖〗阿拉伯糖
Gel〖〗明膠〖〗水解(蛋白酶)〖〗無色素擴散〖〗有色素擴散
Esc〖〗七葉靈〖〗水解(β葡萄糖甙酶)〖〗紫外燈(365nm)黃色—熒光
〖
〗棕黑—無熒光
Gly〖〗甘油〖〗〖〗溴甲酚紫
Cel〖〗纖維二糖
Mne〖〗甘露糖
Mlz〖〗松三糖
Raf〖〗棉子糖〖〗產酸〖〗紫色〖〗黃綠—黃色
Sor〖〗山梨醇
Rha〖〗鼠李糖
Tre〖〗海藻糖
Gat〖〗〖〗觸酶〖〗加2滴過氧化氫于甘露醇管，在空氣中30分鐘后〖〗〖〗〖〗無氣泡〖〗有氣泡
Spor〖〗〖〗芽胞〖〗無〖〗有
Gram〖〗〖〗革蘭氏染色〖〗紅色(陰性)〖〗紫色(陽性)
Cocc〖〗〖〗菌體形態(tài)〖〗桿狀〖〗球狀
觀察后判斷“+”及“-”并在報告單上記錄結果，同化試驗觀察以有無細菌生長(混濁)作為
陽性/陰性判斷標準。
二分子生物學技術
近年來，隨著分子生物學的不斷發(fā)展和各項新技術的廣泛應用，有關微生物種屬間親緣關系
的分類鑒定工作，正從一般表型特征的鑒定深化為遺傳特征的鑒定，技術上也從一般形態(tài)、
生理生化、血清學試驗等提高到分子水平。目前用于微生物分類鑒定的分子生物學方法有：
DNA中鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)摩爾百分比(mol%)的測定、核酸分子雜交和PCR技術等。
1、細菌的DNAG+Cmol%的測定
G+Cmol%作為鑒別細菌種屬間親疏關系的一個重要遺傳型特征，在細菌分類鑒定中的作用已
被公認，它有助于對表型(如形態(tài)、抗原抗體反應和理化特征)上難以區(qū)分的細菌作分類鑒定
，使分類鑒定依據(jù)由表現(xiàn)型向遺傳型特征深化，并有助于分子水平上探索生物進化的親緣關
系。
不同細菌DNA中的G+Cmol%是不同的，變化幅度寬(30～75%)，但同種細菌的G+Cmol%比較穩(wěn)定
，不受菌齡影響，也不受突變因素之外的生長條件等各種外界因素的影響，所以G+Cmol%用
于細菌分類鑒定極有重要意義。
①G+Cmol%含量不同payment-defi.com的細菌，肯定是不同種的細菌；G+Cmol%含量相同的細菌，可能是相近的
種屬，但也可能是不相同的細菌，需通過核酸雜交技術和表型特性確定。
②兩株細菌的G+Cmol%含量差別在2%以內無意義；若差別有4～5%，可認為是同種內的不同菌
株；若差別在10～15%，可認為是不同屬，甚至是不同科的細菌。
2、DNA限制性核酸內切酶圖譜(指紋圖)分析
限制性核酸內切酶能識別和切割雙鏈DNA的特異部位，產生大小不同的片段，經凝膠電泳后
在凝膠上形成獨特的DNA片段帶譜。利用薄層掃描儀和計算機，比較不同微生物DNA的特征性
指紋，可以了解它們的同源程度。
如將核酸標記同位素后再行切割和電泳，通過放射自顯影，就可在底片上出現(xiàn)不同的斑點，
構成指紋圖，從而對病原體基因組的異同進行分析，最后做出鑒定。
因此，限制性核酸內切酶分析是一個重復性、穩(wěn)定性、敏感性均很好的方法，可快速得到結
果，已成功地應用于病毒和細菌的鑒定分型。
3、核酸探針診斷技術
不同的生物體具有不同的DNA序列，同種生物體含有相同的DNA序列，并且核苷酸序列是相對
穩(wěn)定的。DNA分子在一定條件下，可以解鏈成兩條單鏈分子。因此，可以利用核苷酸序列互
補的原理，用特異的核酸探針，通過核酸雜交來檢測和鑒定微生物。
核酸探針是指能識別特異堿基序列的，帶有標記的一段單鏈DNA或RNA分子，也可以說是一段
與被測定的核苷酸序列(靶序列)互補的、帶標記的單鏈核苷酸。標記物通常有放射性同位素
、生物素、地高辛等。常用的核酸探針技術有如下幾種：
①斑點雜交法將待測的核酸直接點在硝酸纖維膜上，經加熱或堿處理，使雙鏈的DNA或RN
R解鏈，變成單鏈，然后用已知的探針進行雜交。如果待檢的DNA與探針DNA是變性同源的，
便會按配對原則，復性成雙鏈，將探針固定在濾膜上。最后根據(jù)標記方法的不同，進行不同
手段的檢測。
②Southern印跡法DNA經內切酶切割、瓊脂糖凝膠電泳分離，然后轉移到硝酸纖維素膜上
，再與標記的探針雜交及檢測。
③Northern印跡法是將RNA混合物經凝膠電泳分離后，轉移到DBM纖維素膜上，再與標記的
探針進行雜交和檢測。
④原位雜交是用標記的核酸探針直接與組織切片的細胞或菌落進行特異的DNA或RNA雜交。
此法可保持細胞的基本形態(tài)，在完整的細胞上進行核酸雜交反應，有利于細胞內基因定位和
檢測基因表達。
目前，核酸探針技術主要用于痢疾桿菌、霍亂弧菌、EB病毒、乙型肝炎病毒和艾滋病毒等常
規(guī)診斷。由于此法快速、簡便、特異，且敏感性可達1～10pg的DNA水平，所以在快速診斷領
域中是主要競爭者，對于不易分離培養(yǎng)或大量培養(yǎng)增殖后有危險性的微生物標本，用核酸探
針技術進行檢測更有著特殊的優(yōu)越性。
4、聚合酶鏈反應(PCR)
聚合酶鏈反應又稱“體外基因擴增”，是1985年由美國MullisKB等人首創(chuàng)的一項新技術，具
有快速、簡便、靈敏、特異等特點，可在短短的幾小時內將pg水平DNA中特定序列的單個拷
貝擴增到百萬倍，從而為基因的檢測工作提供了大量的基因材料。PCR已廣泛應用于病原微
生物的檢測、遺傳性疾病的診斷等領域。
PCR原理是利用DNA聚合酶依賴于DNA模板的特性，在試管內模仿體內DNA的復制，使復制過程
限定在一對人工外源加入的“引物”之間進行。這對引物是依據(jù)被擴增區(qū)DNA片段的兩側邊
界DNA序列人工合成的，通常為20bp左右，每一引物與相對應的一條DNA鏈互補。人工合成的
兩個引物決定了擴增DNA序列的特異性。PCR反應包括下述三個步驟：
①變性(denature)經加熱后，DNA雙鏈解離形成兩條單鏈。
②退火(anneal)當反應溫度降低時，兩個引物分別結合到靶DNA的兩個單鏈的3′末端。
③延伸(extension)在四種脫氧三磷酸核苷存在的條件下，由TaqDNA多聚酶催化，使引物
沿著模板DN
A的3′→5′方向延伸，以靶DNA鏈為模板合成一條新的雙鏈DNA。新合成的DNA鏈經變性解離
后，又可作為模板，與剩余的引物結合，并在DNA聚合酶的催化下再次延伸，合成新的DNA鏈
。如此反復進行上述三個步驟，可使靶DNA片段呈指數(shù)性擴增。經20～40個循環(huán)，在
短短的幾小時內，DNA序列可擴增百萬倍。由于PCR的放大作用本身具有特異性，故擴增后的
DNA只要用電泳或簡單的非同位素標記的探針即可檢測出來，易于在臨床推廣應用。
目前，PCR技術已廣泛應用于各種病原體的檢測，用于發(fā)現(xiàn)一些不易分離培養(yǎng)的病原體，檢
測一些不易獲得的少量標本，如人體活檢組織；或病原體含量較少的標本，如食器飲水標本
；還可用來研究腫瘤病毒在細胞基因整合狀態(tài)和位置，用于研究病毒與腫瘤的關系等。隨著
PCR技術的進一步完善，尤其是自動化的實現(xiàn)，必將給微生物診斷技術帶來巨大的推動。
(龍北國張文炳趙衛(wèi)羅軍)
