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2.2 方法
本實(shí)驗(yàn)程序包括培養(yǎng)hep-2 細(xì)胞， 提出總RNA, 行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)， 擴(kuò)增 COX-2編碼區(qū)基因 （CDS)。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物回收、酶切， 并正向克隆至pCDNA3.1（+) 載體中， 通過(guò)酶切、測(cè)序、鑒定重組質(zhì)粒， 導(dǎo)入hep-2 細(xì)胞中。具體如下： 培養(yǎng)細(xì)胞、提取總RNA 常規(guī)培養(yǎng)人喉癌細(xì)胞hep-2 細(xì)胞， 當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期， 收獲細(xì)胞。 用提出總RNA, 將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, 再以cDNA 為模版， 行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)， 擴(kuò)增 COX-2 編碼區(qū)基因 （CDS)。
2.2.1 RT-PCR
2.2.1.1 引物設(shè)計(jì)
根據(jù)NCBI（National Center for Biotechnology Information)給出的Cyclooxygenase-2 基因序列（Genbank [gi:34576917] AY382629 DQ782954)， 應(yīng)用Primer premier3 軟件設(shè)計(jì)包括CDS序列在內(nèi)的一對(duì)引物。同時(shí)根據(jù)pCDNA3.1 載體酶譜選取適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶， 將此酶切位點(diǎn)（Hind III 和XbaI)堿基序列分別加入引物的5端， 其酶切位點(diǎn)的前方是加入的保護(hù)堿基， 使其能夠通過(guò)連接將該基因正向插入pCDNA3.11（+)載體內(nèi)， 且保證正確的閱讀框。成熟的COX-2 蛋白為553 個(gè)氨基酸， 此實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的全部序列片段長(zhǎng)度， 包括酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基為1734bp。引物放在包括一段CDS 以外的mRNA 位置時(shí)， 能夠擴(kuò)增出目的片段 （因在起始端 （ATG) 自然序列引物不能擴(kuò)出理想的目的片段)。設(shè)計(jì)的引物序列如下：
上游引物： 5'- TATAAGCTTCCCTCAGACAGCAAAGCCTA-3；下游引物： 5'- CTAGTCTAGACTACAGTTCAGTCGAACGTTCTTTTAG-3' 。
2.2.1.2 酶切位點(diǎn)
引物內(nèi)斜體字是引入的酶切位點(diǎn)， 分別是Hind III、XbaI。此引物委托北京諾賽基因公司合成。以下加粗字體是Cyclooxygenase-2 基因CDS 的自然序列， 前50 個(gè)堿基 （非加粗字體) 是CDS 之前的mRNA, 方框內(nèi)是引物對(duì)應(yīng)的序列。醫(yī)學(xué)全在.線payment-defi.com
2.2.1.3 PCR 反應(yīng)體系
按上述順序加入各組分后混合均勻， 上機(jī)反應(yīng)。PCR反應(yīng)參數(shù)為：98℃預(yù)變性30s, 98℃變性12s, 65℃退火40s, 72℃延伸10s, 30個(gè)循環(huán)后， 72℃再延伸5min, 4℃ 保存。反應(yīng)結(jié)束后， 先取6μlPCR產(chǎn)物， 在1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
2.2.2 PCR 產(chǎn)物的回收和純化將PCR 產(chǎn)物用膠回收試劑盒（D2501-02, E.Z.N.A. Gel Extraction Kit, Omega Bio-Tek, Inc)回收、純化。
2.2.3 目的基因亞克隆
2.2.3.1 將PCR 產(chǎn)物連接到T 載體上
此PCR 反應(yīng)體系中使用的高保真DNA 聚合酶擴(kuò)增出的PCR 產(chǎn)物是平末端。在將PCR產(chǎn)物連至表達(dá)載體之前需將其連接到T 載體（已連接拓?fù)湟讟?gòu)酶)上， 此T 載體也是平末端，故已完成PCR 產(chǎn)物3端不需要加A（腺嘌呤)。根據(jù)T 載體和PCR 產(chǎn)物的摩爾濃度按1:5 比例計(jì)算， 根據(jù)DNA Marker 亮度大致確認(rèn)濃度。其反應(yīng)過(guò)程如下。
PCR產(chǎn)物 2μlT載體 1μlddH2O 2μl25℃ 15min
2.2.3.2 將T 載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中
將T 載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，其步驟如下：
① 將50μl E.col DH5α 感受態(tài)細(xì)胞加入1.5mL 離心管中， 置冰浴中；② 將已和T 載體連接好的PCR 產(chǎn)物1μl 加入到此離心管中， 輕輕混勻；③ 將離心管放置冰浴中靜置30min;④ 30 min 后將離心管放置42℃恒溫水浴中靜置90s, 要穩(wěn)固、不可搖晃；⑤ 迅速將離心管置冰浴中靜置3min;⑥ 向離心管中加入500μl LB 液體培養(yǎng)基， 放入37℃搖床中培養(yǎng)90min, 180 轉(zhuǎn)/分鐘；⑦ 將菌液涂布在含有100μg/mL 氨芐青霉的瓊脂培養(yǎng)基上， 37 ℃放置， 待表面的液體吸收后倒置此平板培養(yǎng)基， 繼37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。次日在培養(yǎng)基上出現(xiàn)了菌落。
