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2.2.3.3 PCR 方法篩選陽性克隆菌株
取平板培養(yǎng)基上的數(shù)個菌落分別放入各試管中， 在試管上標(biāo)記后， 各加入10μl 純凈水，混勻、震蕩。以下分兩方面進(jìn)行。一方面將其菌液取出1μl 作模板， 行PCR 檢測 （PCR 反應(yīng)體系和程序參照上述)。從PCR 反應(yīng)的結(jié)果看， 其中有多個轉(zhuǎn)化子的電泳得到與目的基因（1721bp)大小相一致的條帶， 認(rèn)為是轉(zhuǎn)化成功。另一方面， 做PCR 余下的菌液再加入5 ml LB液體培養(yǎng)基， 移至37℃搖床中， 180 轉(zhuǎn)/分鐘， 培養(yǎng)過夜。PCR 完成后， 根據(jù)以上PCR結(jié)果， 將符合要求菌落的菌液分別測序。
2.2.4 片段連接到表達(dá)載體
環(huán)狀空質(zhì)粒也同時雙酶切。取2μl 再次電泳，對比DNA Marker 大致確認(rèn)濃度。根據(jù)載體和目的片段的摩爾濃度按1:3 比例計(jì)算， 用T4 連接酶將目的片段連接到表達(dá)載體（pCDNA3.1)。
2.2.5 將連接好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中
轉(zhuǎn)化過程同前（略)， 培養(yǎng)大腸桿菌、擴(kuò)增過程同上（略)。經(jīng)菌株測序篩選陽性克隆， 確定已連接的菌株， 加入10%滅菌的甘油，-80 ℃保存待使用。
3.討論
由于有越來越多的證據(jù)說明COX2 蛋白在腫瘤的形成過程起到多方面的中樞作用， 有較多的文獻(xiàn)支持用COX-2 作為靶蛋白處理各種腫瘤細(xì)胞， COX-2 蛋白處理已成為化學(xué)治療腫瘤的一部分。就目前已經(jīng)明確的資料顯示：COX-2 蛋白的過表達(dá)涉及以下諸方面生物學(xué)行為：腫瘤新生血管生長、細(xì)胞增生、凋亡、有絲分裂、細(xì)胞粘連、免疫監(jiān)視等。
鱗狀細(xì)胞癌是常見的頭頸部惡性腫瘤。大多SCC 中均可發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子3 的信號轉(zhuǎn)換器和激活素（signal transducer and activator of transcription 3, Start3)的表達(dá)， 它的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞的生長相關(guān)[20、21]。研究報(bào)告發(fā)現(xiàn)： NSAID 抑制COX-2 和Survivin 的下調(diào)， 使細(xì)胞增生的抑制和凋亡的發(fā)生是通過抑制Start3 的通路完成的。研究也看到， 在早期的頭頸部腫瘤病人，Start3 的高表達(dá)和腫瘤的發(fā)展可能伴隨病人的預(yù)后不佳。
COX-2 的活化促進(jìn)了PGs 的合成水平， 促使了腫瘤新生血管生長的因子血管上皮生長因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF)蛋白的升高， 這將刺激腫瘤的新生血管生長。醫(yī)學(xué)全在.線payment-defi.com
采用基因治療方法， 促使進(jìn)展期腫瘤缺血、壞死也是新的抗腫瘤策略之一。已經(jīng)有些研究發(fā)現(xiàn)： 某些蛋白的表達(dá)和腫瘤的慢性缺血狀態(tài)相關(guān)， Survivin 和糖元調(diào)節(jié)蛋白（Glucose-regulated protein 78, Grp/78)是能夠在腫瘤慢性缺血時被表達(dá)下降的蛋白。因此腫瘤的慢性缺血和Survivin、Grp/78 表達(dá)的水平被研究和觀察。研究者可能的意圖是： 使用NSAID 相繼使COX-2 和Survivin 抑制， 如果Survivin 蛋白能夠在腫瘤慢性缺血時被下調(diào)表達(dá)， 那么， 使用NSAID 致COX-2 抑制， 進(jìn)而使Survivin 抑制， 就可能干預(yù)腫瘤的慢性缺血的過程， 或者是可能有助于延續(xù)腫瘤的缺血狀態(tài)， 就加重了腫瘤細(xì)胞的壞死和最終的消退。但是另一些研究有不盡相同的結(jié)果。同時， 實(shí)驗(yàn)者還看到在腫瘤組織缺血的導(dǎo)致survivin 水平顯著的下降， 使得腫瘤組織極其明顯地增加了對Celecoxib （一種選擇性抗COX-2 的NSAID)抗腫瘤的敏感性。另外， 腫瘤組織的缺血狀態(tài)， 誘導(dǎo)了Grp/78 蛋白， 而后者又有一定的抑制survivin 表達(dá)的下調(diào)的作用。因此，為了澄清這一生物學(xué)過程， 最終得到NSAIDs 控制腫瘤細(xì)胞的生長的目的， 達(dá)到使用NSAID 致COX-2 抑制， 進(jìn)而下調(diào)survivin 的表達(dá)， 干預(yù)腫瘤的缺血的過程， 成為一種實(shí)驗(yàn)和臨床追求的實(shí)際效果， 更深入的研究是必要的。
COX-2 調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白survivin 而促使細(xì)胞的生存, 抑制凋亡是通過抑制survivin通路完成的。
以上幾方面是文獻(xiàn)報(bào)告的實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 也是我們今后的研究方向， 我們將借鑒這些觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和理論依據(jù)， 應(yīng)用我們已經(jīng)構(gòu)建的COX-2 原核表達(dá)載體pCDNA3.1, 研究和評價COX-2 基因和蛋白質(zhì)在hep-2 細(xì)胞和其他頭頸腫瘤細(xì)胞中對下游的靶蛋白的相關(guān)的影響。具體的實(shí)驗(yàn)方案是將帶有COX-2 基因COX-2 原核表達(dá)載體pCDNA3.1, 用轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)入hep-2細(xì)胞或其他頭頸腫瘤細(xì)胞中、培養(yǎng)細(xì)胞， 并且應(yīng)用NSAIDs 來干預(yù)腫瘤的發(fā)展， 在mRNA 和蛋白兩個水平上檢測相關(guān)因子， 借以研究和評價COX-2 對下游的各相關(guān)靶蛋白的影響。
