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公共衛(wèi)生醫(yī)學論文酶消化結合組織塊培養(yǎng)法
1 引言
TMJ 是人體內最復雜的關節(jié)之一，其運動和功能中心位于下頜骨髁狀突和顳骨關節(jié)面之間無血管的纖維軟骨組織--關節(jié)盤，而大約70%的TMJ 關節(jié)紊亂病(temporomandibulardisorder, TMD)與關節(jié)盤病變有關，主要表現(xiàn)為關節(jié)盤變薄、透明樣變、穿孔等特征。迄今為止，臨床治療的主要目的在于恢復關節(jié)盤的生物力學功能和緩解癥狀，治療方法雖多，但沒有一種可治愈此病的好方法。關節(jié)盤組織工程的興起為治療關節(jié)盤疾病提供了一個有較好前景的治療新方法，但由于自體關節(jié)盤纖維軟骨組織量少、取材困難，如何運用少量的關節(jié)盤組織，在適宜的條件下分離及培養(yǎng)獲取數(shù)量多、活性高及分化功能良好的種子細胞是當前TMJ 關節(jié)盤組織工程的重要問題之一。近年來，有關TMJ 關節(jié)盤組織工程研究中關節(jié)盤細胞的體外培養(yǎng)多為采用II 型膠原酶一步消化法[5-11]。但是，微量的關節(jié)盤組織經(jīng)過長時間的酶解后細胞的損失量較大，獲得的細胞數(shù)量較少，不利于細胞的大量增殖。若按照文獻中提供的方法獲取關節(jié)盤細胞則需要大量的TMJ 關節(jié)盤自體組織，必然增加研究的成本和費用。本實驗嘗試使用組織塊培養(yǎng)結合酶消化法對關節(jié)盤細胞進行體外培養(yǎng)研究，為體外擴增關節(jié)盤細胞進行組織工程研究提供一種新的方法。
2 材料與方法
2.1 方法
2.1.1 關節(jié)盤纖維軟骨細胞的分離實驗動物標本來自當?shù)赝涝讖S，1 月齡山羊共8 只，每只質量約10kg。在無菌條件下完整切取山羊雙側TMJ 關節(jié)盤，用含100 U/ml 雙抗（青霉素、鏈霉素)的PBS 液沖洗3 次，修剪去周圍組織。放入盛有無血清的高糖DMEM 滅菌培養(yǎng)皿中，用眼科剪將關節(jié)盤纖維軟骨組織剪成1.0 mm3 大小的碎塊后移入三角燒瓶中，加入5 倍體積的0．25％胰蛋白酶， 37℃恒溫搖床中振蕩消化30 min 后，用含雙抗的PBS 洗滌二次。再加入0.01% I 型膠原酶繼續(xù)消化3h，含雙抗的PBS 洗滌二次。將消化好的關節(jié)盤組織塊以每孔9 塊，距離 5～10mm的密度置入6 孔培養(yǎng)板中，并在組織塊表面放置一24×24 mm 的蓋玻片，輕壓，防止加入培養(yǎng)液時組織塊浮起。
2.1.2 原代培養(yǎng)
向上述接種有組織塊的培養(yǎng)板中緩慢加入DMEM 培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清，100 U/ml靑、鏈霉素，25 mg/L 抗壞血酸)，于5％CO2 飽和濕度、37℃恒溫箱下培養(yǎng)，72h 后半量換液，以后隔日換液逐日在相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。醫(yī).學.全.在.線網(wǎng)站提供。
