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2.1.3 傳代培養(yǎng)
待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%，取出蓋玻片，用眼科鑷夾出組織塊后，將0.25% 胰蛋白酶1.0 ml加入培養(yǎng)瓶，輕搖至消化液流遍所有細(xì)胞表面后，倒掉消化液后再加1.0 ml 新的消化液進(jìn)行消化，在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后立即加入含血清的DMEM 培養(yǎng)液中止消化。用吸管上下吸放數(shù)次以打散細(xì)胞團(tuán)塊，混和均勻后，收集細(xì)胞懸液，低速離心(800 rpm, 5 min)。計(jì)數(shù)，按1:2 比例從6 孔板傳代于培養(yǎng)瓶中，按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)。
2.1.4 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定
取生長(zhǎng)良好的 1～3 代細(xì)胞，計(jì)數(shù)后以2×104/ml 的細(xì)胞濃度接種于96 孔培養(yǎng)板，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)細(xì)胞接種4 孔，每孔100μL 細(xì)胞懸液。置于5% CO2 飽和濕度、37℃恒溫箱下培養(yǎng)。從第2 天起，每天上午同一時(shí)間開(kāi)始加入濃度為5 mg/ml 的3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基四氮唑嗅鹽(MTT)10 μl 混勻, 繼續(xù)孵育4h 后加入100μl 十二烷基硫酸鈉(SDS)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上570 nm 處檢測(cè)每個(gè)孔的吸光度(OD 值)，取平均值，以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸，以不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白孔為對(duì)照。連續(xù)測(cè)一周，繪制生長(zhǎng)曲線。
2.1.5 甲苯胺藍(lán)染色取第 1 代培養(yǎng)細(xì)胞，固定后加入10 g/L 甲苯胺藍(lán)染液，室溫下染色30min，蒸餾水洗，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察細(xì)胞的染況，照相記錄。
2.1.6 I 型膠原免疫組化染色細(xì)胞傳代后，以第1 代作細(xì)胞爬片，培養(yǎng)第4 天時(shí)取出，PBS 液沖洗3 次，用4% 多聚甲醛固定30min，蒸餾水洗，入體積分?jǐn)?shù)3%的過(guò)氧化氫室溫孵育5min，滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育10min，傾去血清后滴加適當(dāng)比例稀釋的I 型膠原蛋白一抗工作液(1:50)，4℃過(guò)夜；PBS 沖洗，3 min×3 次；滴加生物素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，37℃,15 min；PBS 沖洗，3 min×3 次；滴加試劑辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃，10 min；DAB 顯色劑室溫顯色3 min 后，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。鏡下觀察細(xì)胞的染況，照相記錄。
2.1.7 主要觀察指標(biāo)在倒置顯微鏡下連續(xù)觀察細(xì)胞的形態(tài)變化及貼壁率，甲苯胺藍(lán)染色、I 型膠原免疫組化染色進(jìn)行細(xì)胞鑒定，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線。
3 結(jié)果
3.1 倒置顯微鏡觀察
細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及生長(zhǎng)情況培養(yǎng)至第 4 天，在組織塊的周邊區(qū)域可見(jiàn)爬出的細(xì)胞，散在排列，細(xì)胞呈梭形或三角形。
7 天后，細(xì)胞為長(zhǎng)梭形，多角形，部分細(xì)胞突起互相連接。培養(yǎng)至第10 天,細(xì)胞彼此相連，長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿底面的80%，有細(xì)胞重疊現(xiàn)象，此時(shí)應(yīng)適時(shí)傳代。傳代后1h 細(xì)胞即開(kāi)始貼壁。2h 后開(kāi)始伸展，貼壁細(xì)胞形態(tài)為多角形，短梭形。6h 已經(jīng)能適應(yīng)體外培養(yǎng)條件，增殖速度加快，4～5 天后即可貼滿瓶底。
