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3.2 生長曲線的測定
纖維軟骨細胞第1～4 代細胞生長曲線基本相同, 呈S 形，接種后1 天細胞數(shù)稍有減少, 經(jīng)過24～48h 的潛伏適應期后, 細胞大量增加, 進入對數(shù)生長期, 第5 天細胞生長減緩，進入平臺期。
3.3 關(guān)節(jié)盤纖維軟骨細胞鑒
定甲苯胺藍染色胞漿呈紫藍色。I 型膠原免疫組化染色顯示胞漿染成黃色, 而胞核不染色。
4 討論
山羊的TMJ 關(guān)節(jié)盤在大小、形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能方面與人的關(guān)節(jié)盤比較相似，與其他實驗動物如豬，狗，牛等相比取材容易，價格低廉，故本實驗采用1 月齡健康山羊作為研究對象。在組織結(jié)構(gòu)上TMJ 關(guān)節(jié)盤由大量I 型膠原、水和蛋白多糖及稀少的纖維軟骨細胞和彈性纖維組成。關(guān)節(jié)盤纖維軟骨基質(zhì)含量高而細胞含量低，需要通過將組織塊反復剪碎并且消化酶消化的方法使致密的膠原松散化，以利于細胞的爬出。文獻報道的方法多為使用Ⅱ型膠原酶消化關(guān)節(jié)盤組織以獲取關(guān)節(jié)盤細胞。但由于關(guān)節(jié)盤本身的組織量較少，并且在臨床應用過程中，多數(shù)采用穿刺活檢的方法獲取局部的組織，由于長時間的消化和反復洗滌離心，會對細胞造成損傷，獲取的細胞量往往十分有限；此外，長時間的消化會破壞細胞膜表面的整合素,從而影響細胞的粘附力,并造成胞外基質(zhì)合成時基因表達的改變，從而影響細胞合成胞外基質(zhì)、維持表型及增殖的能力，很難實現(xiàn)細胞體外生長和擴增的目的。
組織塊培養(yǎng)法消化時間較短，操作簡單，適用于組織量較少的原代細胞的培養(yǎng), 并且組織塊中含有大量的生長因子，通過剪切，可以使這些生長因子游離出來釋放到培養(yǎng)基中，對細胞的體外生長起積極作用。TMJ 關(guān)節(jié)盤幾乎都由I 型膠原構(gòu)成，所以本實驗采用了I 型膠原酶聯(lián)合胰酶對組織碎塊進行消化，使組織疏松以便細胞的爬出。未經(jīng)處理的組織塊往往不易帖壁，從而影響細胞的遷出及增殖，常用的解決方法為在細胞培養(yǎng)容器壁上涂以鼠尾膠原或多聚賴氨酸,本實驗將消化后的組織塊用蓋玻片覆蓋，這有利于置入塊早期的固定和帖壁，使細胞更易遷出和生長，而且操作簡單。本實驗的細胞在10 天即可形成細胞簇，傳代后的纖維軟骨細胞貼壁時間縮短，增殖速度加快，在體外可以實現(xiàn)快速大量擴增。有關(guān)于兔TMJ 關(guān)節(jié)盤細胞培養(yǎng)的研究發(fā)現(xiàn)細胞傳至10 代以后，其增殖速度并未減緩，說明培養(yǎng)的纖維軟骨細胞尚未發(fā)生反分化趨勢。
TMJ 關(guān)節(jié)盤及膝關(guān)節(jié)半月板同屬纖維軟骨，與透明軟骨細胞不同，后者分泌的細胞外基質(zhì)成分主要是II 型膠原，而纖維軟骨細胞則以分泌I 型膠原為主。實驗采用甲苯胺藍和I 型膠原免疫組化染色證實了TMJ 關(guān)節(jié)盤細胞所具有的纖維軟骨的特征，與課題組在另外的研究觀察相一致。醫(yī).學.全.在.線payment-defi.com
本實驗結(jié)果顯示，采用將組織塊消化一定時間后對組織塊進行培養(yǎng)，待細胞簇連結(jié)成片后傳代，即可實現(xiàn)體外擴增TMJ 關(guān)節(jié)盤細胞的目的，此方法操作簡單、易行，為實現(xiàn)TMJ關(guān)節(jié)盤組織工程中纖維軟骨細胞的大量體外擴增提供了新的可行的方法。但是，使用組織塊培養(yǎng)法是否會影響TMJ 關(guān)節(jié)盤細胞表型特征的維持以及是否需要通過改善細胞環(huán)境以促進細胞外基質(zhì)的分泌還有待進一步研究。
