 |
 |
1 材料與方法
1.1 材料 人宮頸癌Hela細(xì)胞由河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室提供;大蒜素(二烯丙基代磺酸酯)購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)院藥房;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、Ho33342、碘化丙啶(PI)為美國(guó)Sigma產(chǎn)品;DMEM、新生牛血清為美國(guó)Gibco產(chǎn)品;Bcl2、Bax單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):人宮頸癌Hela細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下靜置培養(yǎng)。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 MTT法檢測(cè)大蒜素對(duì)細(xì)胞增殖的影響：細(xì)胞以5×104/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后，每孔加入不同濃度的大蒜素各100 μl，濃度分別為1、5、10、20 μg/ml，對(duì)照組加入含10%FBS的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)12、24、48 h后，分別向每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 100 μl，振蕩5 min;酶標(biāo)儀檢測(cè)(吸光度為550 nm)。每時(shí)間濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所得OD值根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率(%)=(1-OD實(shí)驗(yàn)組/OD正常組)×100%，以空白組OD值調(diào)零。
1.2.3 大蒜素誘導(dǎo)宮頸癌：Hela細(xì)胞凋亡最適濃度篩選以上各實(shí)驗(yàn)組加入大蒜素作用24 h，加入Ho33342(濃度10 μg/ml)37℃溫育20 min，再加入PI(濃度50 μg/ml)，熒光顯微鏡觀察并記錄圖象。
1.2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：10 μg/ml大蒜素分別作用0～24 h，每隔2 h顯微鏡觀察1次，隨機(jī)選取視野記錄圖象。
1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)：大蒜素對(duì)細(xì)胞周期的影響：細(xì)胞以5×104/ml-1接種于25 cm2培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)48 h后，加入10 μg/ml大蒜素，分別培養(yǎng)12、24 h，棄培養(yǎng)液，加入0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心8 min收集細(xì)胞。細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次后，500 μl PBS懸浮細(xì)胞，加入含10 μg/ml的RNase的PI，4℃染色30 min。經(jīng)200目濾網(wǎng)過(guò)濾后，上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Modifit軟件進(jìn)行細(xì)胞周期各期的百分率分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)大蒜素對(duì)Bcl2和Bax的影響：細(xì)胞以5×104/ml接種于25 cm2培養(yǎng)中，培養(yǎng)48 h后，加入10 μg/ml大蒜素分別培養(yǎng)12和24 h，收集細(xì)胞，以PBS清洗3次，70%乙醇4℃固定1 h。經(jīng)PBS再次清洗后，不同時(shí)間組細(xì)胞分別加入兔抗人Bcl2或兔抗人Bax一抗，37℃孵育1 h，PBS清洗后加入FITC標(biāo)記山羊抗兔二抗，37℃避光孵育20 min。陰性對(duì)照PBS代替一抗。PBS 清洗3次后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)件，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站payment-defi.com。
2 結(jié)果
2.1 大蒜素對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞活性的影響 MTT結(jié)果顯示1～10 μg/ml大蒜素均能抑制Hela細(xì)胞的增殖 ，呈時(shí)間劑量依賴性關(guān)系;20 μg/ml大蒜素細(xì)胞毒性作用明顯，作用12 h，細(xì)胞抑制率為74.71%，作用24 h以后細(xì)胞幾乎全部死亡。見表1。表1 大蒜素對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用
2.2 大蒜素誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡最適濃度的篩選Ho33342和PI染色結(jié)果提示，各濃度組中，10 μg/ml大蒜素對(duì)Hela細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡作用最明顯;20 μg/ml大蒜素主要表現(xiàn)為細(xì)胞毒性作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選取10 μg/ml作為最適誘導(dǎo)濃度來(lái)探討其作用機(jī)制。
2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察正常條件下Hela細(xì)胞呈梭形或多角形，傳代培養(yǎng)48 h，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，有聚團(tuán)現(xiàn)象;10 μg/ml大蒜素作用6 h，細(xì)胞開始出現(xiàn)形態(tài)學(xué)改變，緊貼瓶壁的細(xì)胞邊界模糊，部分細(xì)胞縮起，分裂相減少;大蒜素作用12 h開始有凋亡小體出現(xiàn);大蒜素作用24 h，大部分細(xì)胞回縮變圓，凋亡小體明顯，部分細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，細(xì)胞碎片增多。
