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挑取含重組質(zhì)粒pET28aSjc HGPRT的BL21(DE3)細(xì)菌的單個(gè)菌落,接種于3 ml LB/Kan (30 μg/ml)培養(yǎng)液中,37 ℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,1 ml過夜培養(yǎng)菌轉(zhuǎn)種于100 ml LB/Kan (30 μg/ml)培養(yǎng)液中,37 ℃ 250 r/min振蕩培養(yǎng)4 h,至D(600 nm)≈0.6時(shí),加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1 mmol/L誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá),25 ℃ 250 r/min誘導(dǎo)后4 h,收集培養(yǎng)液,5 000×g離心15 min,棄上清,重懸細(xì)菌沉淀于50 ml PBS中,冰浴高強(qiáng)度超聲30 s,停30 s,超聲3次,10 000×g離心15 min,離心后收集上清,用Qiagen公司的組氨酸親和層析柱純化蛋白。SDSPAGE電泳分析目的蛋白,紫外分光光度儀測(cè)定蛋白質(zhì)濃度[D(260 nm)和D(280 nm)]。
1.3 動(dòng)物免疫
將52只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為5組,第Ⅰ組為感染對(duì)照組,第Ⅱ組和第Ⅲ組分別為弗氏佐劑對(duì)照組和Montanide ISA 206佐劑對(duì)照組,第Ⅳ組為reSjc HGPRT加弗氏佐劑免疫組,第Ⅴ組為reSjc HGPRT加Montanide ISA 206佐劑免疫組。每組10～12只小鼠。第Ⅳ和第Ⅴ組每只小鼠頸背部多點(diǎn)皮下注射乳化的20 μg重組抗原和弗氏或Montanide ISA 206佐劑,共免疫3次,間隔2周。其中第Ⅳ組小鼠第一次注射用佐劑為弗氏完全佐劑(FCA),加強(qiáng)免疫時(shí)為弗氏不完全佐劑(FIA)。第Ⅱ組和第Ⅲ組小鼠則同法注射乳化的生理鹽水加弗氏或Montanide ISA 206佐劑,感染對(duì)照組小鼠不注射任何抗原、佐劑或生理鹽水。
1.4 攻擊感染
末次免疫后2周,各組每只小鼠經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴(30±1)條。攻擊感染6周后剖殺小鼠,門靜脈灌注收集蟲體,計(jì)算減蟲率和減雌雄合抱率。減雌雄合抱率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均檢獲雌雄合抱數(shù)/對(duì)照組平均檢獲雌雄合抱數(shù))×100%。肝臟稱重,加20～40 ml 8%的KOH,37 ℃,250 r/min消化3 h,取100 μl消化液涂片,在4倍光鏡下進(jìn)行蟲卵計(jì)數(shù),重復(fù)涂片3次,取均數(shù),計(jì)算每克肝組織蟲卵數(shù)(EPG)。
1.5 小鼠血清特異性抗體水平檢測(cè)
分別于第一次免疫前、尾蚴攻擊感染前和剖殺前,經(jīng)小鼠尾靜脈采血并分離血清,-20 ℃保存?zhèn)溆�。采用酶�?lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定小鼠血清中特異性IgG抗體水平。reSjc HGPRT抗原2 μg/孔包被,加含5%小牛血清的0.01 mol/L PBS 37 ℃封閉2 h;加待測(cè)小鼠血清(1∶100稀釋,稀釋液為含5%小牛血清的PBS),37 ℃孵育1 h,用PBST(0.1% Tween20)洗滌3次,每次5 min;加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶1 000稀釋),37 ℃孵育1 h;PBST洗滌3次,最后一次以PBS洗滌,加鄰苯二胺(OPD)顯色液顯色,2 mol/L H2SO4 終止反應(yīng),測(cè)得各組光密度值[D(490 nm)]醫(yī)學(xué) 全在.線提供payment-defi.com。
1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
運(yùn)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA),并進(jìn)行t檢驗(yàn)。
2 結(jié) 果
2.1 reSjc HGPRT重組抗原的鑒定
pET28aSjc HGPRT/BL21工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE分析表明,重組抗原Mr約29 000(含載體的6個(gè)組氨酸),純化的抗原純度較高(圖1),濃度為2.58 mg/ml。
2.2 免疫保護(hù)作用
與感染對(duì)照組相比, reSjc HGPRT加Montanide ISA 206佐劑免疫組小鼠所檢獲成蟲數(shù)最少,減蟲率為53.7%(P<0.05); reSjc HGPRT加弗氏佐劑組減蟲率次之,為43.3%(P<0.05);Montanide ISA 206佐劑組的減蟲率也較低(P<0.05)。reSjc HGPRT加Montanide ISA 206佐劑免疫組雌雄合抱減少率為59.3%;而reSjc HGPRT加弗氏佐劑組與感染對(duì)照組相比雌雄合抱減少率為44.1%(P<0.05)。
與感染對(duì)照組相比,reSjc HGPRT加Montanide ISA 206佐劑免疫組肝臟減卵率最高,為44.9%(P<0.05)、 reSjc HGPRT加弗氏佐劑免疫組減卵率為33.0%,Montanide ISA206佐劑對(duì)照組和弗氏佐劑組也有一定的減卵率(表1)。表1 日本血吸蟲HGPRT重組抗原免疫小鼠減蟲率、減雌雄合抱率和肝減卵率
2.3 ELISA檢測(cè)免疫鼠血清特異性抗體(IgG)
末次免疫后7天,重組抗原加弗氏佐劑免疫組和重組抗原加Montanide ISA 206佐劑免疫組小鼠血清中特異性IgG水平明顯升高,與感染對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);與弗氏佐劑對(duì)照組相比,抗體水平差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。而感染對(duì)照組小鼠免疫前、免疫后血清中特異性抗體IgG水平無明顯變化(P>0.05)。另外攻擊感染后各組血清特異性抗體均升高(表2)。表2 ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清特異性IgG抗體: P<0.001,與Ⅰ組相比;b: P<0.001,與Ⅱ組相比;c:P>0.05,d:P<0.01,組內(nèi)與免疫前相比
3 討 論
疫苗被作為血吸蟲病綜合防治重要的措施之一而倍受關(guān)注,WHO專家認(rèn)為,化療手段(短效)必須與長(zhǎng)效的措施(疫苗)相結(jié)合[2],才能有效地控制血吸蟲病,因此尋找新的疫苗候選抗原是當(dāng)今血吸蟲疫苗研究的熱點(diǎn)之一。HGPRT是一種與調(diào)控細(xì)胞核苷酸代謝有關(guān)的酶,在血吸蟲的體內(nèi)有很高的活性,與血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。HGPRT通過嘌呤核苷酸補(bǔ)救途經(jīng)形成核苷肌苷酸(IMP)或鳥苷酸(GMP),是血吸蟲體內(nèi)鳥嘌呤和(或)次黃嘌呤合成鳥嘌呤核苷(guanosine monophosphate,GMP)必不可少的一種酶。HGPRT活性的喪失會(huì)直接導(dǎo)致寄生蟲體內(nèi)鳥嘌呤的缺乏,從而阻斷DNA的合成,使寄生蟲細(xì)胞不能分裂,無法發(fā)育[3,4],從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡,因而被認(rèn)為是抗曼氏血吸蟲病化療有希望的靶抗原[5]。近來,在日本血吸蟲的疫苗研究中發(fā)現(xiàn),日本血吸蟲HGPRT被證明存在于日本血吸蟲SIEA中[6]。用日本血吸蟲HGPRT重組蛋白免疫昆明鼠的研究發(fā)現(xiàn),其減卵率水平較高[7]。
