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1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和分組
選用由四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的健康成年新西蘭大白兔36只，體重為2.3～2.5 kg，雌雄不限。采取自身對(duì)照設(shè)計(jì)，在雙側(cè)咬肌區(qū)分別植入不帶骨膜自體橈骨，一側(cè)在骨髓腔內(nèi)植入頜外動(dòng)脈（實(shí)驗(yàn)側(cè))，對(duì)側(cè)不植入動(dòng)脈（對(duì)照側(cè))，左右側(cè)不限。手術(shù)后3 d、1周、2周、3周、4周、6周各處死動(dòng)物6只，取材。其中3只用于墨汁灌注和常規(guī)組織學(xué)檢測(cè)，另3只用于CD34免疫組化染色。
1.2 手術(shù)方法
將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用0.3 g/L戊巴比妥鈉耳靜脈麻醉，常規(guī)脫毛，將其仰臥于手術(shù)臺(tái)上，四肢固定。常規(guī)消毒鋪巾，于一側(cè)咬肌前緣皮膚作2.5 cm長縱行切口，暴露并游離一段長2.0 cm頜外動(dòng)脈，鉗夾剪斷并結(jié)扎遠(yuǎn)端。無菌條件下行一側(cè)前肢中段外側(cè)縱行切口約2.0 cm，暴露橈骨，環(huán)行剝離骨膜顯露橈骨，橫行切斷橈骨中段，長約2.0 cm。將游離的動(dòng)脈近心端自橈骨骨髓腔穿入，固定并植入鄰近咬肌中（橈骨在空氣中的暴露時(shí)間不超過15 min)，慶大霉素生理鹽水反復(fù)沖洗術(shù)野，嚴(yán)密縫合肌層及皮膚。對(duì)照側(cè)直接將另一側(cè)游離橈骨植入咬肌區(qū)�？p合雙側(cè)前肢切口。術(shù)后6 d使用青霉素，肌注20萬單位，每天2次。手術(shù)后8 h給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)食，單獨(dú)喂養(yǎng)。
1.3 檢測(cè)方法
1.3.1 移植骨的組織學(xué)檢測(cè) 術(shù)后3 d、1周、2周、3周、4周、6周各處死3只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，切取移植骨板，標(biāo)本經(jīng)10％中性甲醛溶液固定，10％乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)溶液脫鈣，按常規(guī)組織學(xué)方法制成連續(xù)石蠟切片，片厚5 μm，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE)染色。
1.3.2 移植骨血管墨汁灌注 灌注液選用70％墨汁右旋糖苷（70 mL中華牌墨汁和30 mL低分子右旋糖苷)。采用頸動(dòng)靜脈插管，將肝素生理鹽水緩慢注入動(dòng)脈管，待頸靜脈導(dǎo)管內(nèi)流出清亮液體后即可緩慢注入70％墨汁右旋糖苷，灌注壓力不超過16.0 kPa。待兔頭面頸部變均勻濃黑后立即解剖取下雙側(cè)咬肌區(qū)橈骨，10％中性甲醛溶液固定，制成脫鈣石蠟切片（5 μm)，HE染色，觀察再血管化情況。
微血管密度（microvessel density，MVD)的測(cè)定參照Weidner法[1]：對(duì)墨汁灌注標(biāo)本組織切片進(jìn)行圖像采集，切片在40倍光鏡下挑選微血管分布最高區(qū)域，在200倍視野下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的被墨汁染成黑色的血管數(shù)目，取其平均值作為MVD，每一個(gè)與鄰近的微血管明顯分離的黑色血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞簇都視為獨(dú)立的微血管。
1.3.3 移植骨微血管CD34免疫組化染色 術(shù)后3 d、1周、2周、3周、4周、6周各處死3只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，切取移植骨板，標(biāo)本經(jīng)70％乙醇固定，80％、90％、95％、100％乙醇逐級(jí)脫水，甲基丙烯酸甲脂包埋、切片，片厚5 μm。切片經(jīng)常規(guī)烤片、脫塑至水，免疫組化SABC法抗CD34抗體染色，蘇木素復(fù)染，加拿大樹膠封片，光鏡下進(jìn)行觀察。
CD34以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)呈棕褐色為陽性表達(dá)，對(duì)CD34免疫組化染色切片進(jìn)行圖像采集，切片在40倍光鏡下挑選微血管分布最高區(qū)域，在200倍視野下計(jì)數(shù)5個(gè)視野的被染成棕褐色的血管數(shù)目，取其平均值作為MVD，每一個(gè)與鄰近的微血管明顯分離的染成棕褐色的血管內(nèi)皮細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞簇都視為獨(dú)立的微血管。
1.3.4 組織學(xué)切片圖像分析 術(shù)后3 d、1周、2周、3周、4周、6周各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)側(cè)從3個(gè)脫鈣標(biāo)本和3個(gè)不脫鈣標(biāo)本中分別隨機(jī)抽取2張組織學(xué)切片，共計(jì)12張，每一張切片再隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)脫鈣和不脫鈣切片分別為30個(gè)觀察樣本數(shù)；對(duì)照側(cè)選片同實(shí)驗(yàn)側(cè)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)脫鈣和不脫鈣切片分別為30個(gè)觀察樣本數(shù)。用Nikon DXM1200顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行觀察，SPOT Cool CCD攝像頭采集圖像進(jìn)入計(jì)算機(jī)，采用Image-Pro Plus 6.0版本專業(yè)圖像分析軟件對(duì)數(shù)碼圖像進(jìn)行分析醫(yī).學(xué).全.在.線payment-defi.com。
1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析數(shù)據(jù)，組間比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA)，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 移植骨HE染色及血管墨汁灌注觀察結(jié)果
術(shù)后3 d，實(shí)驗(yàn)側(cè)移植骨髓腔內(nèi)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞生長，髓腔和骨板見少量墨汁充盈；對(duì)照側(cè)移植骨髓腔內(nèi)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞生長，髓腔和骨板未見墨汁充盈。術(shù)后1周，實(shí)驗(yàn)側(cè)移植骨髓腔內(nèi)炎癥細(xì)胞聚集，成纖維細(xì)胞增多，骨細(xì)胞位于陷窩內(nèi)，髓腔和骨板見墨汁充盈增多；對(duì)照側(cè)移植骨髓腔和骨板仍未見墨汁充盈，部分骨陷窩空虛。術(shù)后2周，實(shí)驗(yàn)側(cè)移植骨髓腔內(nèi)炎癥細(xì)胞聚集，膠原纖維呈不規(guī)則、紊亂排列，成骨細(xì)胞活躍，髓腔和骨板仍見墨汁充盈較多；對(duì)照側(cè)移植骨髓腔和骨板見少量墨汁充盈。術(shù)后3周，實(shí)驗(yàn)側(cè)移植骨哈佛管擴(kuò)大，膠原纖維排列有序位于骨小梁周圍，骨形成和吸收活躍，髓腔和骨板仍見墨汁充盈；對(duì)照側(cè)移植骨髓腔和骨板仍見少量墨汁充盈，哈佛管擴(kuò)大。術(shù)后4周，實(shí)驗(yàn)側(cè)移植骨哈佛管進(jìn)一步擴(kuò)大，膠原纖維明顯增多，骨小梁形成，髓腔和骨板見大量墨汁充盈，哈佛管內(nèi)可見多根血管充盈墨汁，骨吸收陷窩內(nèi)血管充盈墨汁（圖1)；對(duì)照側(cè)移植骨髓腔和骨板見墨汁充盈增多，哈佛管內(nèi)可見血管充盈墨汁，骨吸收陷窩內(nèi)見血管充盈墨汁（圖2)。術(shù)后6周，兩側(cè)移植骨髓腔內(nèi)炎癥細(xì)胞減少，膠原纖維充滿髓腔，排列有序，骨改建中，髓腔和骨板見墨汁充盈，但數(shù)量減少。
