醫(yī)學(xué)免費論文:pET15b�瞃ARA�睧GFP原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及融合蛋白YARA�睧GFP的表達(dá)與純化

1.2.5 YARA�睧GFP融合蛋白的定量：用Bradford法[10]對純化蛋白進(jìn)行定量，以標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)對照。取考馬斯亮藍(lán)G��250染液2 mL裝入石英管中，在595 nm處用紫外分光光度計調(diào)零，然后加入10 μL標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白(1 mg/mL)，再取一只石英管加入2 mL考馬斯亮藍(lán)G��250染液和透析后的YARA�睧GFP蛋白10 μL，混勻，分別用紫外分光光度計在595 nm下測定兩種蛋白的吸光值。融合蛋白YARA�睧GFP濃度(mg/mL)=(測定樣品在595 nm處的OD值/標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白在595 nm處的OD值)×1 mg/mL。

2 結(jié)果

2.1 pET15b�瞃ARA�睧GFP重組質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建的pET15b�瞃ARA�睧GFP經(jīng)XhoⅠ和XbaⅠ雙酶切，陽性克隆含有長度約137 bp和6 428 bp的兩條帶(圖2)，說明YARA編碼序列成功地插入到酶切大片段的XhoⅠ和NdeⅠ位點。

2.2 pET15b�瞃ARA�睧GFP重組質(zhì)粒的測序

重組質(zhì)粒pET15b�瞃ARA�睧GFP的測序結(jié)果顯示編碼YARA的DNA序列成功插入到酶切后的質(zhì)粒中，編碼YARA的DNA序列與人工合成的YARA編碼序列完全一致(圖3)。

2.3 YARA�睧GFP融合蛋白的定量

經(jīng)Bradford法測定，純化后的YARA�睧GFP蛋白濃度為1.098 mg/mL。

2.4 YARA�睧GFP融合蛋白的定性

考馬斯亮藍(lán)凝膠染色和Western blot結(jié)果顯示YARA�睧GFP融合蛋白分子量約為29 kD(圖4)，與預(yù)期的分子量相符。

3 討論

細(xì)胞穿透肽(Cell penetrating peptides，CPPs)是一些通過非能量、非胞吞途徑把蛋白質(zhì)、肽段和DNA等大分子物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的小于30個氨基酸的肽段[1]，CPPs能攜帶靶蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮生物效應(yīng)。CPPs具有轉(zhuǎn)運效率高、毒性低、體內(nèi)外均可應(yīng)用、對運載物質(zhì)的大小無明顯限制、無免疫原性，不引起炎癥反應(yīng)、且對進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)的量可有效控制并使其保持在生理濃度范圍等優(yōu)點，而在物質(zhì)運輸領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。目前發(fā)現(xiàn)的CPPs主要有HIV��1 反式激活因子的TAT、單純皰疹病毒VP22、果蠅觸角足蛋白同源結(jié)構(gòu)域Antp以及人工設(shè)計的CPPs，如PEP��1和YARA等。但TAT介導(dǎo)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)需要融合蛋白在導(dǎo)入前進(jìn)行變性，才能使融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。變性的TAT融合蛋白進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，需HSP90家族成員將靶蛋白重折疊為天然有活性的構(gòu)象，因此導(dǎo)入蛋白的生物活性依賴于HSP90分子伴侶的重折疊效率[11]。為了提高轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白進(jìn)入細(xì)胞后的生物活性，需要設(shè)計一種新的轉(zhuǎn)導(dǎo)肽將靶蛋白以一種天然有活性的結(jié)構(gòu)形式轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。Morris小組[12]設(shè)計合成了一個21個氨基酸的肽段載體PEP��1，研究表明PEP��1能把GFP、SOD、β�睪al、右旋糖苷、各種抗體等大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入多種哺乳動物細(xì)胞內(nèi)[12-15]。董曉等[16-18]發(fā)現(xiàn)PEP��1能有效攜帶目的蛋白EGFP穿透進(jìn)入人血管平滑肌細(xì)胞、小鼠皮膚并分布于表皮和真皮，在體研究發(fā)現(xiàn)PEP��1能介導(dǎo)EGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)入心、腦、肝、脾、腎組織內(nèi)。醫(yī).學(xué).全.在.線payment-defi.com

TAT有一個強的α螺旋結(jié)構(gòu)，其有一面富含精氨酸殘基，為進(jìn)一步提高CPPs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，Ho等[9]在α螺旋的一面優(yōu)化精氨酸殘基的位置和用丙氨酸殘基來替代部分氨基酸序列(丙氨酸具有最大的α螺旋穩(wěn)定值)，以得到更加穩(wěn)定的α螺旋結(jié)構(gòu)的CPPs，即YARA，其序列為：YARAAARQARA。YARA在二級結(jié)構(gòu)上是雙親結(jié)構(gòu)，親水部分可能有利于精氨酸上帶正電的胍基與細(xì)胞表面結(jié)合，而疏水部分可能更加有利于穿透細(xì)胞膜。實驗證明YARA能介導(dǎo)大分子物質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)入離體和在體的細(xì)胞內(nèi)并且其轉(zhuǎn)導(dǎo)能力較TAT有明顯增強，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是TAT的33倍。

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