三 離心方法
隨著離心設(shè)備的迅速發(fā)展，離心方法也有了很大的提高。為分離分析不同要求的樣品，建立了不同的離心方法，一般分為制備離心方法和分析離心方法。根據(jù)待分離物質(zhì)理化性能的不同，制備性離心可分別采用差速沉淀離心、速度區(qū)帶離心和等密度離心等。要獲得最佳分離效果，采用這些方法時(shí)，還要選擇合適的離心轉(zhuǎn)頭。
離心轉(zhuǎn)頭的選擇
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轉(zhuǎn) 頭 類 型 |
分 離 方 法 |
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速度沉淀 |
速度區(qū)帶 |
等 密 度 |
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角度轉(zhuǎn)頭 |
極好 |
差 |
好 |
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垂直轉(zhuǎn)頭 |
差 |
好 |
極好 |
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甩平轉(zhuǎn)頭 |
無效 |
好 |
適當(dāng) |
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區(qū)帶轉(zhuǎn)頭 |
差 |
極好 |
適當(dāng) |
(一)差速離心
差速離心系指低速與高速離心交替進(jìn)行，用大小不同的離心力使具有不同沉降系數(shù)的分子分批分離的方法。它適用于沉降系數(shù)的差別在一個(gè)到幾個(gè)數(shù)量級(jí)的混合樣品的分離。Ｓ差別越大，分離效果越好。差速離心常用來分離各種亞細(xì)胞器及粗提核酸和蛋白質(zhì)。例如被分離的物質(zhì)是一種組織勻漿，可以根據(jù)各種亞細(xì)胞器的沉降系數(shù)大小，選擇不同的離心速度和適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，每一組分即被彼此分離開。由于各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時(shí)是均勻地分布的，所以很明顯，不可能在一次離心后得到最重顆粒的純的沉淀制劑，其中也含有一定量的原來就存在的各種成分。醫(yī)學(xué).全在.,線提,供
payment-defi.com可是，將最初的沉淀反復(fù)地懸浮和離心（２～３次)就能得到一個(gè)相當(dāng)純的亞細(xì)胞組分。即使這樣被分離的組分也決不是絕對(duì)均一的，在下面敘述的分離方法中用一種連續(xù)的或不連續(xù)的液體密度梯度代替均勻的懸浮介質(zhì)，從而得到一個(gè)更好的分離。
(二)速度區(qū)帶離心
速度區(qū)帶離心是將樣品置于一個(gè)平緩的介質(zhì)梯度中沉降，該梯度的最大密度低于樣品混合物的最小密度，樣品顆粒按照其不同的沉降速率沉降，從而互相分離。離心一定時(shí)間后不同大小的顆粒將沉降在不同的層次，產(chǎn)生所謂區(qū)帶。由于這種方法是根據(jù)顆粒的沉降速率來完成分離，且離心過程中形成區(qū)帶，所以稱作速度區(qū)帶離心。這種方法適用于分離密度相似而大小有別的樣品。用這種方法可通過密度梯度來維持重力的穩(wěn)定性，同時(shí)抑制對(duì)流。通常待分離顆粒的懸液比溶劑本身重。例如要使這樣的懸液比下面的溶劑輕時(shí)，則必須加入某種介質(zhì)，使其密度連續(xù)或不連續(xù)地增高。在溶劑中加入的這種介質(zhì)，必須考慮到其本身絕不能對(duì)分離顆粒有任何影響，例如引起凝集等。同時(shí)，這種介質(zhì)所形成的密度梯度要相對(duì)穩(wěn)定。經(jīng)常使用的成分為
甘油、蔗糖及某些鹽類，如氯化銫或氯化銣等。顆粒的沉降速度取決于其大小、形狀、密度，也取決于離心力以及懸液介質(zhì)的密度和粘度。蔗糖是對(duì)生物大分子及顆粒進(jìn)行密度梯度分離時(shí)最常用的材料。它易溶于水，而且對(duì)核酸及蛋白質(zhì)具有化學(xué)惰性。常用的梯度范圍是從5%～20%至10～60%。
(三)等密度梯度離心
等密度梯度離心或稱平衡密度梯度離心，是依據(jù)不同生物大分子在浮力密度上的差異，用一種能在離心場內(nèi)自行形成并保持穩(wěn)定的密度平衡溶液，經(jīng)過足夠時(shí)間離心后，各分離物質(zhì)可分別達(dá)到相當(dāng)于自身浮力密度的平衡位置，從而達(dá)到分離的目的。其密度的調(diào)節(jié)，原則上是離心管底部的密度大于生物大分子的密度，而在表面則小于它。這樣，生物大分子就分布
在一個(gè)很窄的范圍內(nèi)。開始離心前，將含有生物大分子及氯化銫的均勻溶液注入離心管中。選擇氯化銫濃度的原則是，使它處在待分離的生物大分子的密度范圍內(nèi)。在經(jīng)過足夠時(shí)間離心后，銫鹽在離心場內(nèi)沉降，從而形成自穩(wěn)的梯度。同時(shí)生物大分子向著離心管內(nèi)梯度中相當(dāng)于其本身浮力密度的某個(gè)位置移動(dòng)，每種生物大分子形成一條狹窄的帶。
綜上所述，差速離心是一種動(dòng)力學(xué)的方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。等密度梯度離心是一種測定顆粒的浮力密度的靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在選擇氯化銫濃度使之處于待分離物的密度范圍內(nèi)。速度區(qū)帶離心兼有以上兩法特點(diǎn)，關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。
(四)離心操作要領(lǐng)
１、精密地平衡離心管和它們的內(nèi)容物是十分重要的。超速離心機(jī)轉(zhuǎn)頭是鑲置在一根很細(xì)的軸上，因此在兩支離心管平衡時(shí)重量之差不得超過各個(gè)離心機(jī)說明書上所規(guī)定的范圍。制備性超速離心機(jī)兩離心管平衡時(shí)重量之差不得超過0.1ｇ。有的普通離心機(jī)帶有離心管套筒，平衡時(shí)應(yīng)帶上套筒。一臺(tái)離心機(jī)的套筒只能在該離心機(jī)上使用，不能在離心機(jī)之間（特別是不同型號(hào)的離心機(jī)之間)混用套筒。
２、平衡后的一對(duì)離心管及其內(nèi)容物（有時(shí)還可能包括離心管套筒)應(yīng)對(duì)稱放置，不能錯(cuò)位，不能裝載單數(shù)的管子，以免因離心所產(chǎn)生的離心力不對(duì)稱而損壞離心軸。
３、當(dāng)平衡的離心管及其內(nèi)容物（或包括套筒)對(duì)稱放置好后，蓋好離心機(jī)蓋子，打開電源，轉(zhuǎn)動(dòng)速度調(diào)節(jié)旋鈕，逐步增加到所需要的離心速度，計(jì)算離心時(shí)間。
４、當(dāng)離心到達(dá)所需要的時(shí)間后，再轉(zhuǎn)動(dòng)速度調(diào)節(jié)旋鈕減速。待離心機(jī)自然停止轉(zhuǎn)動(dòng)后取出離心管。關(guān)閉離心機(jī)電源，拔掉電源插頭，清潔整理離心機(jī)、離心管、套筒、天平等。
５、超速離心機(jī)帶自動(dòng)控制的操作系統(tǒng)，待選定離心速度、時(shí)間等參數(shù)后，按啟動(dòng)開關(guān)，離心機(jī)即自動(dòng)開始轉(zhuǎn)動(dòng)、記錄時(shí)間，并可自動(dòng)停機(jī)（取決于輸入的控制信號(hào))。在離心室被抽成真空前，離心機(jī)只作低速運(yùn)轉(zhuǎn)。
６、超速離心時(shí)，應(yīng)注意選擇合適的離心管和轉(zhuǎn)頭。根據(jù)待離心液體性質(zhì)及體積選擇合適的離心管，裝載液體時(shí)要按各種離心機(jī)具體操作說明進(jìn)行。醫(yī),學(xué)全,在線.搜集.整理
payment-defi.com有的離心管無蓋，液體不能裝得過多，以防離心時(shí)甩出，造成轉(zhuǎn)頭生銹或被腐蝕。制備性超速離心機(jī)的離心管，常常要求必須將液體裝滿，以免離心時(shí)塑料離心管上部凹陷變形。根據(jù)轉(zhuǎn)速選擇合適的轉(zhuǎn)頭，當(dāng)轉(zhuǎn)速超過所用轉(zhuǎn)頭最大轉(zhuǎn)速的2.5%時(shí)，轉(zhuǎn)頭就會(huì)爆炸。轉(zhuǎn)頭在使用前應(yīng)放冰箱內(nèi)預(yù)冷。離心完后，轉(zhuǎn)頭應(yīng)用溫水洗滌并干燥，如必須使用去污劑時(shí)應(yīng)用中性去污劑，擦拭轉(zhuǎn)頭，用水除去全部去污劑再用蒸餾水沖凈。切勿將轉(zhuǎn)頭浸泡在去污劑中。洗凈的轉(zhuǎn)頭放在室溫中干燥，更好的辦法是將轉(zhuǎn)頭擦干，用吹風(fēng)機(jī)吹干，轉(zhuǎn)頭長期不用應(yīng)涂一層上光蠟保護(hù)。轉(zhuǎn)頭在使用中應(yīng)防止與其他物品碰撞，避免造成傷痕，如果發(fā)現(xiàn)有被腐蝕跡象，轉(zhuǎn)頭不應(yīng)再用，因?yàn)樗巡话踩恕?BR>
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