實(shí)用免疫細(xì)胞與核酸:第三節(jié)　FCM對外周白細(xì)胞的免疫熒光分析

外周血是臨床檢驗(yàn)中的重要標(biāo)本。FCM分析外周白細(xì)胞的主要目的是了解各種白細(xì)胞的數(shù)目與分群情況。這些數(shù)字的變化與臨床的某些疾病有一定的關(guān)系。近年來，由于多種識別白細(xì)胞膜表面抗原的單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)，以及對這些單克隆抗體的直接或間接熒光標(biāo)記物的出現(xiàn)，使得利用FCM的熒光組織化學(xué)分析獲得被測細(xì)胞的多指標(biāo)的更多、更準(zhǔn)確的信息，這無疑對警覺臨床和科研有很大幫助。本節(jié)　主要討論有關(guān)外周血的白細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記技術(shù)、數(shù)據(jù)分析及臨床應(yīng)用等方面的問題。

一、白細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

1．白細(xì)胞抗原下面給出世界衛(wèi)生組織對白細(xì)胞抗原的統(tǒng)一命名，以及它們的分子量、對應(yīng)的單克隆抗體及反應(yīng)陽性的細(xì)胞（見表10-2)。

表10-2　WHO對白細(xì)胞分化抗原的命名

a：急性淋巴細(xì)胞性白血病；b：慢性淋巴細(xì)胞性白血病。

2．樣品的制備供FCM分析的樣品是單細(xì)胞懸液，而且大部分樣品都需經(jīng)熒光染色。樣品的制備方法大致有三種：①用熒光單克隆抗體染全血，隨后溶解紅細(xì)胞；②紅細(xì)胞溶解后染色；③通過梯度離心法分離出單個淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，再將之制成細(xì)胞懸液染色。

（1)全血染色后溶解紅細(xì)胞：由于不少血液標(biāo)本具有生物危害性，用此方法可以將染色、溶解、固定、分析幾個步驟都在一個試管內(nèi)進(jìn)行，這樣減少轉(zhuǎn)換過程中的污染。而且此法比用梯度離心分離出單個核細(xì)胞更節(jié)　省時間。由于此法未將粒細(xì)胞去除，故在用FCM分析時，要注意排除粒細(xì)胞的干擾。

具體操作步驟如下：

①全血100～150μl，放入5ml試管，并用50～100μl PBS稀釋，總體積為200μl。]

②熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色30min，4^℃（或放于冰上)。單克隆抗體的濃度因不同來源差異很大，但為了使用方便，可按其說明書配成每次實(shí)驗(yàn)使用10μl。注意蔽光。

③用3～4μl冷BPS清洗。離心250×g（約每分鐘1500轉(zhuǎn))，5min，洗3次。注意每次用吸管將上清吸出，決不能傾倒去液！

④用2ml氯化銨液（配法見下)在室溫下溶解紅血球，約10min。若紅細(xì)胞完全被溶解，溶液由混濁變到透明。注意溶解程度的掌握十分重要：若溶解過分，則導(dǎo)致白細(xì)胞上抗原被破壞，或者某些敏感的細(xì)胞死亡而導(dǎo)致比例的改變。若溶解不徹底，大量紅細(xì)胞會影響對淋巴細(xì)胞的分析。這是因?yàn)榱馨图?xì)胞在分析圖像上與紅細(xì)胞群接近，在框出淋巴細(xì)胞群時，會把部分紅細(xì)胞框定于淋巴細(xì)胞內(nèi)。而紅細(xì)胞溶解不足或過度在很大程度上影響著分析結(jié)果。

【氯化銨液的配制】

Tris—氯化銨1×氯化銨

0.16mol/L 　NH₄Cl 0.38g/100ml　 　90ml0.16mol/LNH₄Cl

0.17mol/L 　Tris 2.06g/100ml 10ml0.17mol/l Tris

pH值7.56 pH值7.2

⑤紅細(xì)胞被徹底溶解，加入1mlPBS稀釋的0.5%甲醛，立即離心，洗3次，條件同步驟③。加入甲醛的目的是盡早固定細(xì)胞和細(xì)胞上的抗原，避免有生物危害的標(biāo)本到處污染。

⑥將染色完成的細(xì)胞懸浮于0.5～1ml的0.1%甲醛溶液內(nèi)。置4^℃，蔽光，等待分析。經(jīng)固定后的細(xì)胞在冰箱內(nèi)可保存一周，這樣對工作的安排會帶來方便。

（2)紅細(xì)胞被溶解后再對白細(xì)胞染色：此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以了解被染白細(xì)胞的數(shù)量以及存活率。但由于有時有些標(biāo)本比較敏感，溶解紅細(xì)胞后，還要經(jīng)過多個染色步驟，這樣容易造成抗原的喪失。此法具體步驟如下：

①室溫下放入14ml氯化銨在15ml的試管里。

②加入0.5～1ml全血，混合3～5min。

③立即離心100～150×g，并用PBS洗2次。

④白細(xì)胞計(jì)數(shù)，注意存活率應(yīng)在90%以上。做成每毫升含5×10⁶白細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞分配到5ml的試管，每試管0.2ml，即1×10⁶個細(xì)胞。

⑤熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色30min，4^℃，避光�？贵w濃度配制如前所述。

⑥PBS洗3次后，用0.5%甲醛固定。方法如前。

（3)用Ficoll—Hypaque梯度離心法分離出單個核細(xì)胞：用此法可以分離骨髓細(xì)胞、淋巴結(jié)、扁桃體搗碎后的單細(xì)胞懸液等。血液標(biāo)本應(yīng)有抗凝劑。取血到分離不能超過6h。

①抗凝全血4～20ml，用等量PBS或Hanks液稀釋。

②稀釋血8或40ml置于15或50ml離心管內(nèi)，4或10ml Ficoll—Hypaque（或者等量的其它分離液，比重為1.007)從離心管底部輕輕加入到血的下面。這種方法對血的擾動較小，比將全血加到Ficoll上面為好。加完后，可以清楚看到Ficoll與全血之間有一明顯的分界線。注意在Ficoll快加完時應(yīng)特別小心，否則有可能加入氣泡攪混血樣，使血與分離液混合，達(dá)不到分離的目的。

③離心350～400g,30min。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞以及死細(xì)胞將位于離心管底部，中間層的單個核細(xì)胞為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些血小板。

④取出中間層中所有細(xì)胞，若在Ficoll中還有細(xì)胞也要取出，這也是單個核細(xì)胞（PBMC)。

⑤用PBS洗3次，第1次清洗時，可用較快速400×g離心10min。因?yàn)橛锌赡苤虚g層中混有一些ficoll，比重增加而細(xì)胞不易沉降。

⑥PBMC計(jì)數(shù)，注意存活率應(yīng)高于90%。配成5×10⁶個/ml的細(xì)胞懸浮液。

⑦取出0.2ml的懸浮液加入到5ml試管（內(nèi)含1×10⁶細(xì)胞)，用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，方法如前。洗3次后固定。注意必須先染色后固定，固定后的細(xì)胞膜通透性改變，會導(dǎo)致熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)入細(xì)胞中去，而在顯微鏡下觀察的染色效果則和死細(xì)胞一樣。當(dāng)用FCM分析時，則均為陽性而達(dá)不到檢驗(yàn)?zāi)康�。這也是用FCM分析的細(xì)胞存活率應(yīng)高于90%的原因。

（4)熒光標(biāo)記抗體的細(xì)胞染色：如前所述，F(xiàn)CM分析被熒光標(biāo)記的抗payment-defi.com/shiti/體染色的細(xì)胞，在選擇熒光染料時必須注意這些熒光染料所需要的激發(fā)光波長是否與所使用的FCM的激發(fā)光譜相匹配。一般各個公司所采用的綠色熒光染料為FITC，而選用的紅色熒光染料卻不盡相同，有的用TRITC，有的用藻紅蛋白（PE)，所需要的激發(fā)光譜就不一樣，因而若因匹配不當(dāng)則會招致熒光抗體所染的細(xì)胞分析不出來，這是應(yīng)該注意的。

這里的標(biāo)本染色方法和免疫熒光法相同。下面僅說明一些具體的注意事項(xiàng)：

①在用間接法染色時，染色步驟依次為第一抗體→清洗→第二抗體→清洗→紅細(xì)胞溶解。為了實(shí)驗(yàn)的方便，將第二抗體也配成每次實(shí)驗(yàn)用10μl。

②雙色法：雙色法多用于直接染色法。將分別用FITC和PE標(biāo)記的抗體各10μl置入同一個含有約1×10⁶/0.2ml的試管內(nèi)，30min，4℃避光。然后清洗、固定。

目前不少制備單克隆抗體的公司已將比值有意義的兩種抗體，分別用紅、綠熒光染料標(biāo)記后，制成一種試劑。如CD₂—FITC/CD₂₀—PE；CD₄-FITC/CD₈-PE等�？砂凑f明使用，具體用量為每次實(shí)驗(yàn)10μl。

③對照組：眾所周知，免疫組化的染色過程中，陰性和陽性對照是必不可少的。在準(zhǔn)備用FCM分析的細(xì)胞時，對照標(biāo)本的制備顯得格外重要。因?yàn)橐淮斡肍CM分析的樣品可能會很多，甚至多達(dá)上百個試管。對同一病人也可能會用到20～30個不同的單克隆抗體。每一個病人都要有相應(yīng)的陰性對照。陰性對照主要用于儀器分析細(xì)胞之前，設(shè)立陰性和陽性的分界線。陽性對照主要用于檢查染色方法。陽性對照細(xì)胞選自那些已知的細(xì)胞和已知的單克隆抗體中的陽性反應(yīng)最明顯者。陰性對照細(xì)胞有以下幾種：

1)非染色細(xì)胞：直接染色法時，用10μlPBS代替與熒光結(jié)合的單克隆抗體，其它步驟相同。間接染色法時，分別用10μl的PBS代替第一抗體和熒光第二抗體，其它步驟相同。

2)使用非特異性的抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg)，代替特異性的單克隆抗體。這是由于所使用的單克隆抗體來自小鼠，可能造成非特異性的假性反應(yīng)，因此使用MsIg作為對照。同時還需要注意選擇與實(shí)驗(yàn)用單克隆抗體亞類一致的MsIg。如大部分單克隆抗體為IgG1，也有部分抗體為IgM，所以用MsIg作對照組時，往往使用MsIgG和MsIgM兩種。直接染色法時，用10μl與熒光結(jié)合的MsIg，代替熒光單克隆抗體。間接染色時，用10μl無熒光的MsIg代替第一抗體。其它步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

3)雙染色對照：將各10μl 的分別與紅熒光染料和綠熒光染料結(jié)合的MsIgg 或MsIgM，加入到同一個試管，代替熒光的特異性單克隆抗體，其它步驟相同。

4)間接法對照：用10μl的PBS代替第一抗體。熒光第二抗體的濃度和使用量均與其它實(shí)驗(yàn)相同，其它實(shí)驗(yàn)步驟也和實(shí)驗(yàn)組相同。

二、白細(xì)胞免疫熒光分析的數(shù)據(jù)分析

在儀器調(diào)試和校準(zhǔn)及標(biāo)本制備完畢之后，就要做測試和數(shù)據(jù)分析工作。這里先討論一下有關(guān)數(shù)據(jù)測量和分析的技術(shù)問題，而一些醫(yī)學(xué)應(yīng)用的具體參數(shù)的測量和分析后面做介紹。

1.0^。散射和90^。散射的雙指標(biāo)的二維圖像分析可以把0^。和90^。散射分別選作二維圖像的X軸和Y軸指標(biāo)。通過圖中數(shù)據(jù)點(diǎn)分布把全血分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞幾個亞群（圖10-9)。

圖10-9　人的外周血白細(xì)胞分群的二維點(diǎn)圖

圖中，A、B圖的淋巴細(xì)胞數(shù)大約有6000～9000個；C、D圖約有2000～4000個。分群編號依次表示：①紅細(xì)胞、死細(xì)胞和渣滓；②淋巴細(xì)胞群；③大顆粒淋巴細(xì)胞；④單核細(xì)胞；⑤粒細(xì)胞。數(shù)據(jù)是對1000個細(xì)胞分析得到的。

若用單指標(biāo)直方圖，對PBMC而言，可以把淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞分開。見圖10-10中的A、B圖。但對紅細(xì)胞溶解后的全血，單指標(biāo)圖分辨率則不夠了（圖10-10的C、D圖)，圖A、B給出的是經(jīng)ficoll后的PBMC；圖C、D給出的是人外周血白細(xì)胞。圖中數(shù)字編號所代表的組分和圖10-9相同。

由上可見，在分析紅細(xì)胞溶解后的全血時，必須先采用雙指標(biāo)二維點(diǎn)圖。從圖上也可清楚地看出，粒細(xì)胞、未被溶解的紅細(xì)胞和一些渣滓，由于不同的體積和致密度，明顯地區(qū)別于淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞從而能把它們分開�？吹角宄�的細(xì)胞分群以后，可以在計(jì)算機(jī)的顯示屏上將所要分析的細(xì)胞畫線框出，并通過指令送入存貯器，以后就可只對框出部分做各種數(shù)據(jù)分析和深入考查。圖10-11就是對雙指標(biāo)點(diǎn)圖上的淋巴細(xì)胞群框定的示意圖。數(shù)字所表示的意思和圖10-9相同。

圖10-10　外周血白細(xì)胞及PBMC的單指標(biāo)直方圖

圖10-11　雙指標(biāo)點(diǎn)圖上細(xì)胞的框定

2．單維直方圖上陰性分界游標(biāo)設(shè)置前面已經(jīng)強(qiáng)調(diào)，在用FCM分析時，陰性對照是必不可少的。首先用非染色細(xì)胞，根據(jù)前面介紹的雙指標(biāo)二維點(diǎn)圖的辦法，將某一細(xì)胞群框定；然后分別選用綠色熒光（GFL)和紅色熒光（RFL)單指標(biāo)直方圖。在直方圖上所出現(xiàn)的細(xì)胞均為陽性�？捎酶淖僄FL和RFL增益的辦法，將細(xì)胞恰好調(diào)節(jié)　到左側(cè)并設(shè)立游標(biāo)（圖10-12)。

然后再測試MsIg染色的陰性對照。某些細(xì)胞，由于膜上的Fc受體可以與對照抗體鼠Ig非特異性結(jié)合，因而有一定的背景染色，不過這種陽性百分率不應(yīng)超過5%。所以MsIg與非染色細(xì)胞的分界游標(biāo)確立后，以后所測試的標(biāo)本以此為標(biāo)準(zhǔn)，游標(biāo)位置基本不變。

圖10-12　陰陽性細(xì)胞分界游標(biāo)的設(shè)置

MsIg的紅、綠熒光陰陽性分界游標(biāo)確立以后，可以測試實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。首先檢查細(xì)胞分群情況，然后檢查淋巴細(xì)胞群是否落在已輸入計(jì)算機(jī)的淋巴細(xì)胞框定的范圍里。若染色及FCM的工作性能都正常，則框定的位置不會改變。然后轉(zhuǎn)換成熒光直方圖。若為FITC標(biāo)記的細(xì)胞，則GFL為X軸；若為PE標(biāo)記的細(xì)胞，則用RFL為X軸。由于陰陽性分界游標(biāo)記已確立，細(xì)胞陽性率及圖像均顯示于計(jì)算機(jī)熒光屏上；同時也可選用其它指標(biāo)和圖像、打印所需的資料等。

3．雙染色分析游標(biāo)設(shè)立和熒光校正

（1)游標(biāo)的設(shè)立：游標(biāo)設(shè)立的原理和單染并無不同，但具體要用二維點(diǎn)圖和二維等高圖來完成。分別選用GFL和RFL為X和Y軸。先用不染色細(xì)胞測試，將陰性細(xì)胞集中在左下角（圖10-13)。分別為X、Y軸設(shè)立游標(biāo)，再用MsIg的陰性對照測試。可將X、Y軸游標(biāo)略為移動，使位于窗“3”內(nèi)的細(xì)胞（陰性)在95%以上。

（2)紅、綠熒光的校正：由于紅色熒光探測器在最佳測試狀態(tài)時，會讓部分綠色熒光進(jìn)入紅色熒光探測器。這是因?yàn)橐徊糠旨?xì)胞發(fā)出的綠色熒光波長較長。若用阻斷或?yàn)V色的辦法消除進(jìn)入紅熒光探測器的這部分GRL，就會大大地降低RFL探測器的靈敏度。因而只好在操作時，通過電子計(jì)算機(jī)預(yù)先進(jìn)入熒光校正，在RFL中適當(dāng)扣除GRL的影響。

通常紅色熒光進(jìn)入綠色熒光探測器的情況比較光見，圖10-14給出CD₁₁-PE（T細(xì)胞、RFL)及CD₈-FITC（T抑制細(xì)胞，GFL)雙染細(xì)胞在二維等高圖上進(jìn)行熒光校正的示意圖。X軸為GFL，Y軸為RFL，由X軸Y軸游標(biāo)劃分的四個窗的陰陽性和圖10-13相同。各窗給出的百分?jǐn)?shù)為該細(xì)胞群所占百分比。圖A表示未經(jīng)校正時的情形。窗“2”內(nèi)31.46%表示雙陽性細(xì)胞，即在T細(xì)胞中31.46%為抑制細(xì)胞毒細(xì)胞。經(jīng)過適當(dāng)校正，可見有兩群陽性雙標(biāo)記細(xì)胞出現(xiàn)（B圖)。高強(qiáng)度部分為真正的CD₈、CD₁₁雙標(biāo)記陽性細(xì)胞；低強(qiáng)度部分屬于CD₈綠色陽性細(xì)胞（NK細(xì)胞)。此時“2”窗中細(xì)胞份額減為7.59%。需要指出的是校正過度則會使各區(qū)的陽性細(xì)胞都減少（圖C)。

圖10-13　雙染色二維點(diǎn)圖上游標(biāo)的設(shè)置

1區(qū)：紅色熒光陽性；2區(qū)　：紅、綠熒光均為陽性；3區(qū)：陰性細(xì)胞：4區(qū)：綠色熒光陽性細(xì)胞

圖10-14雙染色在二維等高圖上熒光校正

雙染色的熒光校正是用電子補(bǔ)償電路來完成的。補(bǔ)償時先測定一種染料的熒光，此時除了應(yīng)該接收該熒光的光電倍增管PMT₁有信號輸出外，另一光電倍增管PMT₂也常會有微弱輸出。調(diào)節(jié)　補(bǔ)償器使PMT₂的輸出為0；然后再測另一種波長的熒光染料，調(diào)PMT_１的補(bǔ)償器使之輸出也為0；然后再測另一種波長的熒光的染料，調(diào)PMT₁的補(bǔ)償器使之輸出也為0：如此反復(fù)調(diào)節(jié)　，使兩種熒光的探測器都獲得補(bǔ)償。實(shí)際調(diào)節(jié)　時用的是一種標(biāo)準(zhǔn)熒光微球，微球上標(biāo)有已知數(shù)量的熒光分子。利用不同的微球可調(diào)整、補(bǔ)償不同熒光的測量通道。需要指出的是：當(dāng)PMT高壓有所改變、激光和濾片系統(tǒng)有所變動時，都要對熒光校正做重新補(bǔ)償調(diào)節(jié)　。

三、淋巴細(xì)胞亞群的測定及其在臨床醫(yī)學(xué)中的實(shí)用意義

淋巴細(xì)胞由于表面特異性抗原的差異可分為四大類（表10-3)，這些不同抗原表現(xiàn)型的亞群執(zhí)行不同的機(jī)能。而且某些疾病會選擇性地?fù)p傷某些亞群而造成亞群之間的比例失調(diào)。根據(jù)FCM雙熒光分析的結(jié)果，現(xiàn)將不同的抗原和不同的機(jī)能的淋巴細(xì)胞亞群列于表10-4。

表10-13 主要淋巴細(xì)胞亞群的表面抗原

＋：表現(xiàn)的抗原；－：未表現(xiàn)的抗原；＋／－：主要亞群有表現(xiàn)的抗原；－／＋：抗原僅表現(xiàn)于少數(shù)亞群。

表10－14　淋巴細(xì)胞機(jī)能性亞群

外周血白細(xì)胞的機(jī)能，特別是淋巴細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)在一定程度上反應(yīng)了機(jī)體的免疫機(jī)能。近幾年來，用FCM來測定某些疾病的淋巴細(xì)胞及其亞群payment-defi.com/sanji/已成為重要的診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)，如對骨髓、器官移植，白血病、淋巴瘤的診斷和對免疫缺陷病的估價等。測定淋巴細(xì)胞亞群的主要依據(jù)是在于淋巴細(xì)胞表面不同的抗原表現(xiàn)型，而這些表現(xiàn)型又依賴于相應(yīng)的單克隆抗體而被識別。所以，特異性很高的單克隆抗體結(jié)合先進(jìn)的FCM，已為臨床提供了不少非常有用而重要的資料，但被FCM所分析的淋巴細(xì)胞的整個臨床意義尚未完全認(rèn)識清楚。隨著更多確定淋巴細(xì)胞表現(xiàn)型的試劑的應(yīng)用，F(xiàn)CM對診斷和治療計(jì)劃的擬定以及預(yù)后的估計(jì)將會表現(xiàn)出更重要的實(shí)用意義。

1．T淋巴細(xì)胞亞群的測定如前所述，在使用FCM分析時，先用0^。散射和90^。光散射雙指標(biāo)將白細(xì)胞分為三群：淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。在二維點(diǎn)圖上劃出淋巴細(xì)胞群范圍后，設(shè)立GFL的RFL單指標(biāo)的直方圖。命電子計(jì)算機(jī)僅計(jì)數(shù)所輸入的淋巴細(xì)胞，即劃線框出的那部分細(xì)胞。一般計(jì)數(shù)輸入的細(xì)胞可設(shè)1000～5000個。直方圖的分析可顯示陽性細(xì)胞的百分率。應(yīng)用輸入細(xì)胞數(shù)、陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)以及白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，就能得到陽性細(xì)胞的絕對值，即每立方毫米血液中的絕對值。有時T淋巴細(xì)胞某亞群的絕對值比百分率更為重要，因?yàn)樗�可以表明T細(xì)胞某亞群的增高和減少。當(dāng)然，淋巴細(xì)胞占白細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)也是一個重要數(shù)據(jù)，應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確測出。

CD₄/CD₈細(xì)胞的比值，有時也用于反映病人淋巴系統(tǒng)的機(jī)能狀態(tài)。不少臨床免疫實(shí)驗(yàn)室已把CD₄/CD₈的值作為常規(guī)血檢查的項(xiàng)目。在國際上，淋巴細(xì)胞亞群以及CD₄/CD₈并未建立統(tǒng)一數(shù)值，各實(shí)驗(yàn)室均需建立自己的標(biāo)準(zhǔn)。平均值一般為1.73～2.00。

一般而言，影響淋巴細(xì)胞亞群的因素較多，如年齡、性別、種族、以及外周圍環(huán)境如季節(jié)　、藥品等的影響。T細(xì)胞的絕對值在兒童略高于成人。嬰兒CD₄細(xì)胞的百分率較成年人高；老年人的CD₈略低。正常人在一晝夜內(nèi)也有周期性的波動：上午CD₄略低，下午4時之后開始增加，直至次晨，平均波動為15%～20%。盡管正常情況下淋巴細(xì)胞亞群有所變動，但仍屬正常范圍。某些疾病，如器官移植、免疫疾病、免疫抑制和一些淋巴細(xì)胞腫瘤，其淋巴細(xì)胞亞群及其比值測量結(jié)果均可能偏離正常范圍。

有工作報道，傳統(tǒng)的T輔助誘導(dǎo)細(xì)胞（CD₄⁺)具有抑制機(jī)能，而在T抑制細(xì)胞毒細(xì)胞（CD₄⁺)中，有些又具有協(xié)助的功能。因此，對原來設(shè)想的CD₄、CD₈的機(jī)能分群有所混淆。預(yù)計(jì)會有新的單克隆抗體再從CD₄和CD₈的細(xì)胞中分出。不過就目前看來，不少臨床免疫實(shí)驗(yàn)室已用CD₄/CD₈比值結(jié)合淋巴細(xì)胞絕對值對多種疾病的診斷、治療和預(yù)后的估計(jì)提供了不少有價值的資料。

2．艾滋病以及HLTV—III感染艾滋病是一種由人類T淋巴細(xì)胞病毒（HLTV--III)感染而造成的疾病。這種病毒主要侵襲CD₄⁺T細(xì)胞，而導(dǎo)致CD₄淋巴細(xì)胞減少，CD₄/CD₈淋巴細(xì)胞比值下降，甚至可低到0.5以下。艾滋病多發(fā)生在同性戀性行為活躍的男性，這可能與多次重復(fù)感染HLTV-III有關(guān)。對異性性行為活躍的人來講，對HLTV—IIi 感染的機(jī)會也不容忽視。另一種感染的途徑是HLTV血清陽性的獻(xiàn)血者對受血者的感染。有部分人血液中T淋巴細(xì)胞減少，CD₄/CD₈比值下降，但HTLV血清反應(yīng)不一定就是陽性。有些人CD₄減少不明顯，但CD₈有所增加，也會導(dǎo)致CD₄/CD₈的的比值下降。

對可疑為艾滋病及血清檢驗(yàn)為陽性的人，T細(xì)胞亞群是分析了解免疫系統(tǒng)被病毒破壞程度的標(biāo)志。初診時，CD₄細(xì)胞越少，CD₄/CD₈值越低者，預(yù)后越差。所以經(jīng)治療后恢復(fù)的指標(biāo)則是CD₄細(xì)胞數(shù)增加，CD₄/CD₈比值升高。用熒光標(biāo)記雙染色的FCM分析的結(jié)果表明，艾滋病人除CD₄和CD₈的改變外，同時還可以表現(xiàn)出OKT₁₀陽性細(xì)胞增多（圖10-15)。病人表現(xiàn)為CD₈和OKT₁₀同時增加時，預(yù)后比OKT₁₀陽性細(xì)胞低的病情嚴(yán)重。

圖10-15　健康人艾滋病人淋巴細(xì)胞表面抗原的比較

艾滋病人Leu₃⁺、Leu₈^-和Leu₃⁺、Leu₈⁺細(xì)胞均減少，而Leu₂⁺、Leu₈^-細(xì)胞相應(yīng)增加，

Leu₂⁺、Leu₇⁺與Leu2₃⁺、Leu₁₀⁺細(xì)胞明顯增加

3．白血病和淋巴瘤的表現(xiàn)型　近年來，為了弄清這些腫瘤的病理組織形態(tài)、影響治療效果的原因與免疫狀態(tài)的相互關(guān)系，對于不同類型的白血病和淋巴瘤作為廣泛的細(xì)胞表面表現(xiàn)型的研究。

在診斷方面，F(xiàn)CM與單克隆抗體結(jié)合，可以弄清這些腫瘤的免疫起源，特別是分清B細(xì)胞性、T細(xì)胞性或骨髓性腫瘤。同時，還可以證實(shí)一些與細(xì)胞起源相關(guān)的抗原，如普通急性淋巴細(xì)胞性白血病抗原（CALLA、CD₁₀)。另外，可以用適當(dāng)?shù)脑噭�從反�?yīng)免疫過程中來證實(shí)單克隆的腫瘤細(xì)胞的增殖。

大部分淋巴系統(tǒng)腫瘤均起源于B細(xì)胞。而B細(xì)胞腫瘤常用抗免疫球蛋白的抗體來證實(shí)。由于前B細(xì)胞與漿細(xì)胞表面均無免疫蛋白，所以用檢測免疫球蛋白的辦法就只能證實(shí)B細(xì)胞發(fā)育中間時期的腫瘤。目前，已有一系列的B細(xì)胞表面抗原被發(fā)現(xiàn)，而可以證實(shí)B細(xì)胞個體發(fā)育的各個時期的腫瘤。

對B細(xì)胞腫瘤最有價值的抗原是CALLA。這種抗原僅存在于B細(xì)胞正常以育期的前B細(xì)胞、早期B細(xì)胞以及80%～90%的急性淋巴細(xì)胞性白血病。因此，抗CALLA抗體可以區(qū)別淋巴細(xì)胞性和髓性白血病。用抗CALLA結(jié)合其它一些成熟B細(xì)胞的單克隆抗體，如CD₁₉，CD₂₀，CD₂₄（B₄，B₁，BA_-1)將能證實(shí)大部分B細(xì)胞來源的腫瘤。圖10-16給出了B細(xì)胞分化的各個時期細(xì)胞膜的表現(xiàn)型。來源于B細(xì)胞的腫瘤和正常B細(xì)胞的表現(xiàn)型相似，也就是說，B細(xì)胞前身、成熟B細(xì)胞及最后分化為分泌B細(xì)胞—漿細(xì)胞。

圖10-16　B細(xì)胞分化各時期的細(xì)胞膜表現(xiàn)型

由于T淋巴細(xì)胞來源的腫瘤浸潤性較強(qiáng)，預(yù)后較差，并需要多種治療。T細(xì)胞腫瘤的表現(xiàn)型千變?nèi)f化，但大部分均表現(xiàn)T細(xì)胞抗原CD₇（Leu₉,3A)或其它T細(xì)胞抗原CD₂、CD₅（OKT₁₁，OKT₁)。這些抗原與腫瘤的細(xì)胞成熟時間有關(guān)，因而有助于擬定治療方案。從FCM分析的結(jié)果表明，非成熟的T細(xì)胞腫瘤常表現(xiàn)非成熟的T細(xì)胞抗原，如CD₁和t₁₀。而成熟的T 細(xì)胞腫瘤則僅表現(xiàn)成熟T細(xì)胞抗原：CD₂、CD₃、CD₅和CD₇。有時也可表現(xiàn)CD₂、CD₈，但不會出現(xiàn)在同一個細(xì)胞上面。

由于腫瘤細(xì)胞的多種來源，很難避免在腫瘤標(biāo)本中混雜正常細(xì)胞，這給FCM的分析帶來技術(shù)上的困難。如殘留的紅細(xì)胞在FCM分析時，落入淋巴細(xì)胞框定的范圍內(nèi)而造成淋巴細(xì)胞各種亞群百分率下降。所以在制備標(biāo)本時，應(yīng)盡量想法去除紅細(xì)胞。另一種污染是正常細(xì)胞存在于腫瘤細(xì)胞之間，這是一個很頭痛的問題。例如骨髓常被外周血污染，反應(yīng)性的正常淋巴細(xì)胞滲入到腫瘤組織中等，因此估計(jì)污染程度對解釋FCM分析的資料有一定的意義。因?yàn)樵贔CM分析時，正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞可能由于不同的體積和密度而被分開，根據(jù)對污染的估計(jì)，仔細(xì)分析圖像就能得到比較正確的結(jié)果。

4．FCM對正常B細(xì)胞和B細(xì)胞腫瘤分析FCM對正常B細(xì)胞和B細(xì)胞腫瘤的分析在免疫學(xué)研究和臨床診斷上有著重要的實(shí)用價值，B細(xì)胞的某些特征必須使用FCM來分析，但是這在FCM技術(shù)方法中仍存在著一些需要解決的問題。

（1)B細(xì)胞的標(biāo)記：B細(xì)胞膜表現(xiàn)免疫球蛋白（SIg)存在于所有成熟B細(xì)胞。最早的B細(xì)胞前身，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有免疫球蛋白M（IgM)，但不存在于細(xì)胞膜表面。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)IgM的證實(shí)以及同時測定細(xì)胞表面的SIg，對FCM是很困難的，當(dāng)然今后可能會用雙染法來解決這樣的難題。大部分成熟B細(xì)胞具有SIgM和SIgD，少量具有SIgG和SIgA，當(dāng)然這也可能是因?yàn)椴煌�的亞群的緣故。但僅以Ig的重鏈來分類B細(xì)胞是不可靠的，因?yàn)锽細(xì)胞可以從膜表面的IgM逐漸轉(zhuǎn)變成IgG，因而從重鏈著手無法把B細(xì)胞分類。大部分B細(xì)胞腫瘤也表現(xiàn)出帶有SIgM和SigD。隨著B細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變成漿細(xì)胞，膜表面Ig 逐漸喪失，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)又出現(xiàn)大量的免疫球蛋白。

與重鏈相反，B細(xì)胞的整個發(fā)生期只有一種k或者λ輕鏈，B細(xì)胞腫瘤克隆僅表現(xiàn)一種輕鏈，因此通過在FCM上顯示的不平衡的輕鏈表現(xiàn)可以確定B細(xì)胞腫瘤。測定方法見（3)。

用SIg的最大缺點(diǎn)是它的“嗜細(xì)胞性”，因?yàn)檎�常B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK)、激活T細(xì)胞以及所有巨噬細(xì)胞均有Fc段受體，因而可以不同程度地與抗SIg單克隆抗體的Fc段結(jié)合而產(chǎn)生非特異性的結(jié)果，因此選擇抗體時，應(yīng)使用已被胃蛋白酶消化過的、Fc段也被去除的、僅留下來的F（ab’)₂。

（2)FCM測定B細(xì)胞的臨床指證：

①免疫缺陷；免疫缺陷可以是先天性或獲得性的。低丙種球蛋白白血癥和無丙種球蛋白白血癥常伴有免疫球蛋白分泌的紊亂，因此有必要分析B細(xì)胞。

②淋巴瘤：非何杰金氏病的淋巴病，80%來源于B細(xì)胞。因而一旦懷疑為淋巴瘤，就應(yīng)仔細(xì)用FCM對B細(xì)胞的表現(xiàn)型進(jìn)行分析，可以分析血、骨髓、以及活檢淋巴結(jié)等。首先確定腫瘤細(xì)胞的來源：B細(xì)胞性（CD₂₀⁺，SIg⁺)或T細(xì)胞性（CD₃⁺)。也有可能某些淋巴病來源于單核細(xì)胞（CD₁₁⁺)成裸細(xì)胞而表現(xiàn)出非T非B。一旦確立為B細(xì)胞來源后，就應(yīng)更進(jìn)一步分析克隆增殖的性質(zhì)：單克隆、少克隆、或是多克降珠。單克隆性的增殖往往是腫瘤的標(biāo)志�？梢杂肧Ig的輕鏈和重鏈分別加以測試，往往輕鏈比重鏈更有價值。在不久的將來，或許可以直接用免疫球蛋白的基本加以鑒別。

對B細(xì)胞亞群的確定，目前并未定論，但某些B細(xì)胞被CD₅（T₁，OKT₁)染色。正常B細(xì)胞中這些細(xì)胞較少，而多見于慢性淋巴性白血病和骨髓移植后的免疫缺陷時期。在B細(xì)胞的腫瘤病人中，10%的也可以出現(xiàn)CD₂₀（B₁)陰性反應(yīng)，這是B細(xì)胞成熟而將分化為漿細(xì)胞的標(biāo)志。在異常B細(xì)胞上，往往有一些B細(xì)胞的標(biāo)記缺失或其它表現(xiàn)型出現(xiàn)，因而對異常B細(xì)胞的FCM的分析尤為重要。圖10-17顯示CD₁₉—FITc （B細(xì)胞)和CD₅-PE（T細(xì)胞)雙染色的假三維圖像分析。X軸為綠色熒光的Leu₁₂(B細(xì)胞)，Y軸為紅色熒光的PE—Leu₁(T細(xì)胞)。從圖中可見，有較多的細(xì)胞表現(xiàn)出Leu₁₂⁺tLeu₁⁺,陰性區(qū)內(nèi)為NK細(xì)胞和紅細(xì)胞等。

圖10-17　異常B細(xì)胞雙染色的假三維圖

（3)k-λ測定B細(xì)胞克隆：k、λ測定法是一種從正常B細(xì)胞中測定少量B細(xì)胞克隆生長的方法。其基本原理是：若有B細(xì)胞克隆存在，將改變某一種輕鏈（k或λ)的熒光強(qiáng)度的分布。若輕鏈為k的B細(xì)胞生長，則抗k的抗體能測試出這種變化，而抗λ的抗體的測試沒有任何改變。正常情況下，B細(xì)胞的k和λ的熒光強(qiáng)度分布是一致的（見圖10-18)。

圖10-18　k-λ克隆的測定

正常情況，B細(xì)胞輕鏈分布圖像，一致κ和λ的波形沒有區(qū)別。但在異常時，若有單克隆生長，κ鏈有分布則與λ不一致，在總和的曲線形態(tài)上也會產(chǎn)生差異。

在實(shí)際應(yīng)用中，血液、體液、組織細(xì)胞的懸浮液效果均較好，而對于骨髓，大量細(xì)胞的非特異性標(biāo)記會影響測定的結(jié)果。這里面必須強(qiáng)調(diào)，正常B細(xì)胞中的克隆細(xì)胞生長并不意味著它們必然是腫瘤細(xì)胞，還必須結(jié)合其它指標(biāo)再做結(jié)論。不過這種方法對確定腫瘤細(xì)胞的存在、細(xì)胞發(fā)育階段、以及經(jīng)治療后病情控制的狀況等，都可以提供一些有用的資料。

以上僅限于從外周血的白細(xì)胞分析這一側(cè)面介紹了FCM的某些疾病中的臨床應(yīng)用。其實(shí)，它也僅只是問題的一個部分。例如，有研究工作表明：CD₃₄抗原在由紅系、巨核系、粒系和巨噬細(xì)胞三個細(xì)胞成株單元組成的成株細(xì)胞中有所表現(xiàn)。CD₃₄⁺細(xì)胞在人的骨髓細(xì)胞中約占1～4%，而在外周血中卻探測不到。又如，NK細(xì)胞近來被認(rèn)為可能和人類的某些疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，對NK細(xì)胞的測量可以作為免疫治療的免疫監(jiān)測的重要參數(shù)和有效的預(yù)后征狀的指示。以前是用放射性的⁵¹Cr的釋放來檢測NK敏感的靶細(xì)胞的毒理學(xué)活性從而評估NK的功能的，而采用熒光探針CFDA（car－boxy—fluorescein diacetate)標(biāo)記則可用FCM技術(shù)更為安全可靠地進(jìn)行測定。有報告指出，健康男人的數(shù)值為（67.1±22.7%)%，健康女人為（63.9±20.0%)；患有婦科癌腫病人則為（38.5±23.1)%,明顯偏低。這些工作表明，F(xiàn)CM的技術(shù)從免疫組織化學(xué)角度還會有所發(fā)展。在第二節(jié)　我們曾簡單介紹了流式細(xì)胞分析技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程中應(yīng)用的一些技術(shù)途徑，這也可以啟發(fā)我們借助于FCM來提高免疫組織化學(xué)的分析能力�？梢灶A(yù)見，F(xiàn)CM一定會成為免疫組織化學(xué)的一項(xiàng)重要的技術(shù)工具，并將在醫(yī)學(xué)科研和臨床應(yīng)用中發(fā)揮更大的作用。

附【美國Becton –Dickinson 公司可提供的FCM標(biāo)準(zhǔn)】熒光微球（Fluorescent beads)；雞紅細(xì)胞核（Chicken erythrocyte nu－clei)和小牛胸腺細(xì)胞核（Calf thymocyte nuclei)，用于DNA測量的質(zhì)量控制；單克隆抗體試劑；以及用于免疫表型（immunopheno－typing)和其它臨床應(yīng)用的藥盒。