實用免疫細胞與核酸:第二節(jié)　FCM在生物醫(yī)學工程學方面的應用

流式細胞術在細胞生物學、分子遺傳學、微生物學、免疫學、分子生物學以及臨床腫瘤學、臨床血液學等諸多領域都有廣泛應用。本節(jié)　概要介紹它們的技術途徑及主要原理，大家可以從中看出它們是和細胞化學密切相關的。

一、FCM應用的技術途徑

FCM是通過測量細胞的多種參量來獲取信息的。細胞參數分為結構參量和功能參量兩大類。結構參量主要用于描述細胞的化學組分和形態(tài)特征；功能參量主要是描述細胞整體的理化和生物特性。這些參量有的需要經熒光標記方可測定，有的并不需要熒光標記。DNA以及RNA的含量，蛋白總含量、胞內pH值和細胞大小等為結構參數；細胞周期動力學、特殊配體的鑒定、特殊細胞的生物活性等則為功能參數。

1．DNA和RNA的測量和分析DNA和RNA的含量可以用多種熒光探針標記后測出。對細胞內DNA含量的測定可用于細胞生物學方面的研究和臨床腫瘤學的診斷；測量RNA的含量可用于血液中的網織紅細胞的檢測和計數；DNA和RNA含量的測定可以用于區(qū)別細胞周期中的G₀和G₁期。常用的熒光探針有吖啶橙（AO，Acridine·orange)、派洛寧Y（PY，Pyronine Y)、HO（Hoechst)系列和色霉素A₃（CA₃)等。利用HO/CA₃雙染色還可分析DNA的堿基組成。還可以結合Brdu (Bromodeoxyuridine, 溴脫氧尿嘧啶核苷)單克隆抗體免疫熒光來測定細胞內DNA合成。

2．蛋白質總量測定用FCM可以測定細胞中蛋白的總含量，以檢測一個細胞群體生長和代謝的狀態(tài)，或區(qū)別具有不同蛋白含量的細胞亞群，如血液中的白細胞的分類。檢測總蛋白的常用熒光探針為異硫氰基熒光素（FITC，Fluorescein isothiocyanate)，FITC以共價鍵方式與蛋白上帶正電的殘基結合。

3．特殊配體的測定配體是與不同的細胞結構特異結合很強的各種大分子和小分子，通過對特異性的熒光標記的配體的測定可以獲得不少有關結構參量和功能參量的信息。例如用標記的外源凝集素可檢測細胞表面糖；用標記抗體可測表面抗原；用標記多聚陽離子可檢測細胞表面電荷；用標記的激素、生長因子、神經遞質和病毒等可檢測細胞受體；用標記的大分子、微生物等可檢測細胞的內吞性；用熒光素標記的親和素以及帶有DUTP的生物素衍生物的DNA探針跟靶細胞的DNA雜交能夠檢測原位的特殊基因等。這方面的應用范圍廣、有前途，已經成為研究細胞和組織中的抗原、基因和各種生化過程的強有力的新技術。用于這方面工作的熒光探針主要有FITC、若丹明系列（如四甲基異硫氰基若丹明TRITC、異硫氰基若丹明X-RITc 和美國德州紅等)、藻膽蛋白系列等。由于各種熒光探針具有不同的光譜特性，在使用中要注意正確地使用激光光源和濾片。

4．生物活性的測定就生物流行性來說，主要包括兩方面工作：①細胞本身的死活；②活細胞生物功能發(fā)揮的強弱。前項工作單一，后項工作要復雜得多。FCM用來判斷細胞死活的常用熒光探針有二大類：一類是能透過活的細胞膜進入細胞內而發(fā)出熒光的物質；例如下醋酸酯熒光素（FDA，flourescein Diacetate)它可被活細胞持留而發(fā)出黃綠色熒光；若細胞有損傷則會從細胞中流失，觀察不到熒光。另一類是不能透過活細胞膜，但能對固定的細胞及膜有破損的細胞的核進行染色，例如碘化丙啶（PI,Propidium iodide)和溴化乙錠（EB,Ethidiumbromide )就是常用的第二類熒光探針。

用FCM來測定活細胞生物功能發(fā)揮方面和性能的指標很多。例如可用來測細胞膜電位、細胞內pH值和細胞內鈣等，這些都和細胞的激活密切相關。FCM也可用來測膜結構的流動性或微粘度等。有報告可以用FCM代替⁵¹Cr的放射免疫分析來測定天然殺傷細胞（NK, Natu-ral killer cells)對靶細胞毒www.med126.com理學活性的大小。

二、FCM的典型應用簡介

下面簡單介紹FCM在各個領域中應用的典型實例，以求對FCM應用的全面了解，并能深入了解FCM在免疫細胞化學中應用的背景。

1．在細胞生物學方面的應用細胞生物學是FCM應用最廣泛也是最基本的領域，細胞周期分析是其基本分析內容之一，而實施的技術途徑是通過測定細胞周期各時相的DNA含量來達到的。

眾所周知，細胞周期由G₁期、S期、G₂期和M期所構成的。各期細胞的DNA含量如下：G₁期為2C，G₂期和M期為4C，S期則在2C到4C之間。所以在FCM的DNA直方圖上形成的譜線則為峰分布，而且G₁峰的道數恰好是G₂和M峰道數的一半（圖10-7)。研究表明：對于正常細胞群，各周期時相的細胞數的比例是同一的；對于惡性病變的細胞群則是非均一的（圖10-8)。

圖10-7　細胞周期的DNA直方圖

圖10-8　細胞周期中的細胞數目與腫瘤的關系

臨床腫瘤病學已經注意到細胞動力學的重要性。研究工作表明：腫瘤細胞對化療和放療的敏感程度與細胞的增生率高低密切相關；采取細胞同步化（Cell Synchronization)措施可以提高療效。例如可以使用雌激素這種外源性藥物讓雌激素受體陽性的乳腺癌細胞同步化。

臨床微生物學可以用FCM對大量細菌的DNA和RNA含量進行測量，進行微生物鑒定、醫(yī)學常規(guī)中的細菌抗生素敏感試驗和傳染活性的測定。

FCM優(yōu)良的分析和分選功能在分子遺傳學領域也能充分發(fā)揮。例如流式細胞核型分析技術就是用FCM對染色體進行分類、純化，檢測或定量測量細胞表面或內部由特異基本所編碼的成份。這方面的成果已用在畜類性別的預選擇，以payment-defi.com/Article/及對人類計劃生育等方面的工作。

2．在免疫學方面的應用　FCM以它的快速、靈活及定量的特點被廣泛地應用于免疫學的基礎研究和臨床應用的各個方面，尤其是結合單克隆抗體技術，在免疫分型、分選、腫瘤細胞的免疫監(jiān)測、機體免疫狀態(tài)的監(jiān)測、免疫細胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面更能起到重要作用，成為現代免疫技術的重要組成部分。基于免疫技術是免疫細胞化學分析技術的基礎，我們著重介紹FCM在免疫應用中的技術問題。

（1)免疫應用的激發(fā)光源和濾片系統(tǒng)：適用于免疫技術的FCM的激發(fā)光是氪離子氣體激光器，光譜中波長為531nm和856nm的譜線最強。為了擴大儀器對雙標記或三標記染色的熒光信號的分辨范圍可使用雙激光光源。

為了減少細胞由于激光束造成的散射光對光電倍增管的影響，要使用貼有干涉膜的濾片系統(tǒng)。為了同時測定兩種波長以上的熒光信號，光路中還要使用二向性分光元件。

為了測定伴隨細胞轉化過程所產生的早期免疫及生化性質的改變，例如膜的流行性，DNA構象變化等，可以使用偏振片。

總之，應用于免疫學時要充分考慮有關光源及光學濾片系統(tǒng)的正確使用。

（2)免疫應用的熒光染料及染色：免疫應用中的熒光染料主要有FITC（488nm)、TRITC（515nm)、PE（藻紅蛋白，575nm)及其組合。在進行多種標記時特別要注意結合抗體的每種色素都不干擾抗體反應的特異性，也不相互干擾。

免疫熒光染色有直接法和間接法二類：

①直接染色法

1)取約10⁶的細胞置于尖底離心管內，管內液體要少些。加熒光標記抗體，在4℃溫度下靜置15～30min。若作雙標記染色也可直接加入。

2)用冷的10%的小牛血清、0.1%的疊氮鈉溶液，1/15mol/L的PBS（pH4.4)離心清洗細胞2次。1000rpm離心5min或4000rpm離心1min。

3)加入適量緩沖液待測。

②間接染色法：

1)取10⁶細胞加特異的第一抗體，4^℃溫度下靜置15～30min。

2)加緩沖液離心清洗2次后，吸盡殘留液體，彈散沉淀，加入熒光標記的第二抗體，4^℃靜置30　min。

3)緩沖液離心清洗2次后加入適量緩沖液待測。為減少無關因素干擾，操作盡量在水浴中進行。

染色中應注意的事項：①細胞標本在整個過程中要盡量保持新鮮，采用有效措施防止表面抗原消失和細胞死亡；②熒光標記物用前應用濾膜或高速離心去除顆粒或沉渣以減少非特異性干擾；③細胞標本染色前應除死細胞；④為提高靈敏度可用三步間接染色法。

（3)免疫熒光標本的特殊處理：

①死細胞及碎片去除：樣品中不可避免地存在著死細胞及碎片，影響分析結果。對于血細胞可用FCM通過0^。散射的差異不經染色而將死細胞分出棄除；對于培養(yǎng)細胞，由于其大小分布不均，可在樣品內加少量PI染色后將死細胞去掉。一般情況下即可用儀器直接去除碎片，也可用血清沉降法去除大碎片，用離法去除小碎片。

②標本的保存和固定：實驗中大多數樣品在染色或分析前需要保存一定的時間，有時甚至需要進行固定。

未染色的新鮮標本貯存方法如下：10%二甲基亞砜，90%小牛血清，5×10^6～1×10⁷細胞在-70^℃過夜，然后置液氮中可長期保存。

免疫染色未經固定的標本在4^℃可保存48h。若需存放時間較長、或標本具有傳染性，應該用固定劑固定。常用的固定劑配方是：1%～4%的多聚甲醛和PBS或0.8%的生理鹽水配成p H7.2的固定液；或用0.37%～1.5%甲醛和PBS配成p H7.4的固定液。固定方法是：將經免疫熒光染色的細胞離心沉淀，再加入固定液混勻，放在4^℃溫度保存。一般來說，經固定處理的標本保存1周至2個月，多數樣品的陽性細胞群體比例及熒光強度增色能保持在正常范圍之內。

（4)主要檢測的免疫指標：

①細胞毒試驗：細胞毒是機體的一種免疫監(jiān)督機制，細胞毒實驗是一項重要的免疫指標。例如天然殺傷細胞NK（Natural killer)是一種引起免疫媒介的效應物，在抗腫瘤及感染因子的免疫監(jiān)督系統(tǒng)中起著重要作用。研究表明，對NK細胞的測量可以做為免疫治療監(jiān)測的重要參數和有效的預后征狀的指標。所使用的熒光探針為CFDA（Caboxy-fluorescein diacetate)。

②吞噬功能實驗：單核吞噬細胞系統(tǒng)是機體的主要防御系統(tǒng)之一。FCM可以快速、定量地檢查吞噬細胞的吞噬能力和速度。

③I型變變態(tài)反應的IgE受體細胞、IgE結合因子的檢查。

④胞漿Ig及血清Ig分析，血小板表面的IgG測定，等等。

3．在臨床方面的應用FCM在臨床診斷、療效評價和預后預測等方面都發(fā)揮了一定的作用。工作做得較多的主要在腫瘤學、血液病學等。這些都和FCM在熒光細胞化學中的直接應用有關。

（1)癌前病變的檢測和預后評價：有效地發(fā)現癌前病變而給予阻斷治療，無疑是腫瘤防治的重要環(huán)節(jié)　。FCM的探測對象主要是癌前細胞，即那些處于正常細胞向癌細胞轉化的量變階段、尚未達到質變的細胞。研究表明，除心肌、肝組織及精子細胞外，人類正常的體細胞都具有恒定的DNA二倍體含量，而那些癌前細胞和癌細胞則在其發(fā)生發(fā)展過程中伴有DNA含量變化異常。另在資料表明：癌前病變向癌變的轉化發(fā)生率與細胞的不典型增生程度有關，而細胞的不典型增生程度又與DNA含量的異常改變呈平行關系。利用FCM可以定量地測出癌前細胞的DNA含量并根據DNA分布直方圖直觀地反映出細胞的周期分布狀態(tài)，從而了解到癌前細胞增殖能力變化的動態(tài)過程，這樣便可以獲得一些從組織形態(tài)學中難以得到的信息。

表10-1 是以胃粘膜為例比較正常細胞和胃癌細胞在DNA含量及細胞周期分布方面的差異。

表10-1　正常與胃癌的胃粘膜細胞DNA含量方面的差異

從表中看出差異是顯著的。我國一些學者也提出有關FCM診斷癌腫細胞的細胞標準，并已付之臨床應用。

目前，對于癌癥病人預后評估的主要依據是病理組織學分級和臨床分期等指標，不少人已認識到用FCM來檢測DNA是對腫瘤預后評價的一個較為客觀有效的指標�？偟膬A向是：異倍體的出現是惡性腫瘤的一個標志；異倍體腫瘤的惡性程度高、復發(fā)率高、轉移率高及死亡率高；二倍體及近二倍體腫瘤預后較好。

在臨床血液學方面的應用目前也以血液系統(tǒng)的腫瘤診斷、分型和預后關系等方面的應用為主；其主要技術途徑也是基于對DNA倍體分析和細胞增殖周期的分析。限于篇幅不再多敘。有關的技術細節(jié)　將在下節(jié)　以FCM在外周血白細胞的免疫組織化學分析方面的應用為例詳加介紹。

（2)DNA指數：由于DNA的非整倍體細胞是腫瘤的特異性標志已經得到腫瘤學界的公認，在些學者提出建議采用流式細胞術DNA分級指數（Flow cytometry DNA Crading Index, 簡稱DNA指數或DI)表示DNA含量的異常程度。根據1984年國際分析細胞學會名詞審定委員會的規(guī)定：

一般樣品應采用同種或同個體的正常細胞為標準二倍體細胞。在血液學研究中通常以正常人外周血淋巴細胞作為標準二倍體細胞。需要指出的是，在報告DNA的測定結果時必需包括G₀/G₁峰的變異和系數，即C.V值，若有多個DNA干系則要給出各個G₀/G₁峰的C.V值。用于腫瘤臨床診斷的總體依據是：a.正常二倍體的DI=1.0，判斷為陰性；b.出現二個或多個可以分辨的G₀/G₁峰則可判斷為陽性；c.雖無明顯的G₀/G₁峰的分化現象，但峰的C.V值較大，則可根據DI數個及其它有鑒別意義的征狀給出參考性的診斷。

以上我們主要從FCM在生物醫(yī)學工程學領域應用的基本原理和技術途徑介紹了和組織化學有關的內容，至于一些技術細節(jié)　則在下節(jié)　做較為詳細的說明。