在細(xì)胞生物學(xué)中，一個(gè)常見(jiàn)的問(wèn)題是如何獲取與細(xì)胞功能相關(guān)的各種定量測(cè)量信息。在免疫細(xì)胞化學(xué)中也存在同樣的問(wèn)題。制作免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本環(huán)節(jié) 較多，只要有一個(gè)環(huán)節(jié) 失誤就會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，除了需要精制的藥品外，還需要熟練的技術(shù)。那么，做成了理想的標(biāo)本后，如何進(jìn)行觀察，才能獲得盡量多的的各種定量信息，而且使這些信息能較客觀的反映出來(lái)，這就是本章 的編寫(xiě)目的。
一、定量分析的重要性
目前有許多研究免疫細(xì)胞化學(xué)的文章 ，是做定性和定位研究的。如有文獻(xiàn)中提到，P物質(zhì)在腦組織中存在于30處以上，這只是解決了定性定位問(wèn)題，這些部位含P物質(zhì)的量是否相同？可否用快速簡(jiǎn)便的方法對(duì)細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)產(chǎn)物的量進(jìn)行分析？從而可進(jìn)行比較。所謂反應(yīng)產(chǎn)物的“量”包括顏色深淺，其所占的長(zhǎng)度或面積等，就要借助于圖像分析儀（image analyzer)了。
以往我們對(duì)免疫細(xì)胞化學(xué)或一般組織化學(xué)光鏡標(biāo)本的觀察，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的量常用“+”號(hào)表示，一般可分為0～+++，共五個(gè)等級(jí)，這種方法對(duì)差別較大的標(biāo)本當(dāng)然還是可以用的，但存在以下三方面的問(wèn)題：①同一張標(biāo)本，不同的觀察者可以得到出不同的結(jié)論，因?yàn)檫@種分級(jí)沒(méi)有明確的客觀標(biāo)準(zhǔn)；②即使同一張標(biāo)本同一個(gè)觀察者，間隔若干天后進(jìn)行再次觀察時(shí)，可能結(jié)論也不一樣的；③最后一點(diǎn)也是最重要的一點(diǎn)，人的視覺(jué)是有一定限制的，用一般觀察法實(shí)際上已經(jīng)丟失掉了許多可貴的信息，因?yàn)槟悴煊X(jué)不到實(shí)際上存在的較小的差異。因此我們力求有一個(gè)客觀的比較精密的標(biāo)準(zhǔn)。除了常用的儀器如顯微分光光度計(jì)(microspectrophotometer)和顯微密度計(jì)（microdensitometer)等以外，還可用圖像分析儀進(jìn)行測(cè)量。前二者已有許多有關(guān)著作中介紹過(guò)，就其精確與靈敏來(lái)說(shuō)都是夠的，但卻不能同時(shí)測(cè)出標(biāo)本中某些成分的面積、體積或長(zhǎng)度等其他極有用的參數(shù)。圖像分析儀的分析廣度則要大得多，并能明顯地提高工作效率，所得到的各種數(shù)據(jù)可通過(guò)分析儀上的計(jì)算機(jī)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，只要將各種統(tǒng)計(jì)學(xué)公式輸入計(jì)算機(jī)，選擇其中你所采用的公式，即可快速得出分析結(jié)果，告訴你有無(wú)顯著性差異。
二、圖像分析儀簡(jiǎn)介
圖像分析儀又稱圖像分析系統(tǒng)（image analysis system)，主要用來(lái)解決如何客觀地較精確地用數(shù)字來(lái)表達(dá)存在于標(biāo)本中的各種信息，可稱為數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)。它已經(jīng)成為一種公認(rèn)的科學(xué)研究工具，并且逐漸展現(xiàn)出巨大的潛能。圖像中包含著極其豐富的內(nèi)容，是人們從客觀世界中獲得信息的重要手段，因此，正確地測(cè)量和處理圖像已成為測(cè)量技術(shù)中的重要課題，并廣泛應(yīng)用于航空遙感測(cè)量、金屬圖像測(cè)量、微電子技術(shù)中微圖形檢測(cè)、精密機(jī)件尺寸檢測(cè)，光波干涉圖、醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究及應(yīng)用等有關(guān)領(lǐng)域中。圖像測(cè)量將會(huì)隨著信息科學(xué)和人工智能的發(fā)展而日益顯示其重要作用。現(xiàn)代圖像測(cè)量是光學(xué)、電子學(xué)、計(jì)算機(jī)技術(shù)等相互滲透的跨學(xué)科的結(jié)果，涉及廣泛的學(xué)科領(lǐng)域，醫(yī)學(xué)只是其中一個(gè)分支。
我們?cè)诠鈱W(xué)顯微鏡下看到的是光學(xué)圖像，而在圖像分析儀屏幕上看到的是電子圖像，因此在顯微圖像分析中，整個(gè)系統(tǒng)最重要最關(guān)鍵的工作就是要保證得到的電子圖像能最精確地反映出光學(xué)圖像，這個(gè)過(guò)程由攝像機(jī)（圖像掃描器)、顯像管和圖像處理機(jī)（計(jì)算機(jī))來(lái)完成（圖9-1)。圖像可通過(guò)光學(xué)顯微鏡、透射電鏡或掃描電鏡傳到攝像機(jī)而產(chǎn)生電信號(hào)，照片或膠卷上的圖像也可以通過(guò)攝像機(jī)反映到電視屏幕上進(jìn)行分析。圖像在電視屏幕上是由許多像素（pixel)構(gòu)成的，單位面積屏幕上像素愈多則圖像愈清晰，即分辨率愈高。各廠家生產(chǎn)各種不同規(guī)格的產(chǎn)品，如有640×480像素的、896×704像素的、512×480像素的屏幕等。當(dāng)圖像顯示時(shí)，每個(gè)像素含有兩方面的信息，即此像素的灰度及其在標(biāo)本中的位置，兩種信息決定了圖像的形狀和顏色深淺。
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圖9-1 圖像分析系統(tǒng)簡(jiǎn)圖
有關(guān)圖像分析的學(xué)術(shù)活動(dòng)，1963年召開(kāi)了第一屆國(guó)際討論會(huì)，此后每四年有一次國(guó)際學(xué)術(shù)交流活動(dòng)。1983年在美國(guó)召開(kāi)了第六屆國(guó)際學(xué)術(shù)會(huì)議，與會(huì)代表約150人。1987年9月在法國(guó)召開(kāi)了第七屆學(xué)術(shù)會(huì)議，在200多正式代表中有2/3是生物醫(yī)學(xué)方面的專(zhuān)家，而我國(guó)生物醫(yī)學(xué)界沒(méi)有人被邀參加，可見(jiàn)我國(guó)過(guò)去對(duì)如何將圖像分析應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)方面的研究重視得不夠，對(duì)國(guó)際上這方面的信息掌握得不及時(shí)。國(guó)內(nèi)自70年代末期相繼從國(guó)外引進(jìn)大型自動(dòng)圖像分析儀后，80年代才開(kāi)始將醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究與圖像分析方法結(jié)合起來(lái)。從1981～1983年召開(kāi)了三次全國(guó)體視學(xué)與圖像圖像分析學(xué)術(shù)會(huì)議，1987年召開(kāi)了第四次學(xué)術(shù)會(huì)議，雖然在宣讀的論文中醫(yī)學(xué)研究已占了很大的比例，但具體應(yīng)用到免疫細(xì)胞化學(xué)則實(shí)例極少，僅是一個(gè)開(kāi)端。1988年中國(guó)體視學(xué)會(huì)正式成立，是在民政部登記的屬于新學(xué)科的第一個(gè)學(xué)會(huì)。并于1991年11月在重慶第三軍大學(xué)召開(kāi)了“全國(guó)計(jì)量學(xué)在形態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用研討會(huì)”，與會(huì)代表來(lái)自22個(gè)省市，形態(tài)計(jì)量學(xué)的方法已應(yīng)用到組織學(xué)、解剖學(xué)、病理學(xué)、細(xì)胞學(xué)等領(lǐng)域。更為可喜的是過(guò)去此類(lèi)研討會(huì)都是請(qǐng)外商到會(huì)介紹他們的產(chǎn)品，為他們提供中國(guó)市場(chǎng)，而此次會(huì)議上本國(guó)的三家研制生產(chǎn)圖像分析儀的單位在大會(huì)上介紹各自的產(chǎn)品，以較好的性能價(jià)格比與國(guó)外產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)，擴(kuò)大國(guó)內(nèi)市場(chǎng)，我國(guó)在此領(lǐng)域的研究進(jìn)展也是很快的。
三、常用的測(cè)量方法
（一)灰度
灰度（grey level)指圖像各種分顏色的深淺程度。比較高級(jí)的圖像分析儀可將灰度分成為256級(jí)，也有的只能將灰度分成64級(jí)，總之都是2n,24是26256是28。免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本上反應(yīng)產(chǎn)物的染色深淺即可用灰度來(lái)表示。能將一張標(biāo)本上不同染色深度區(qū)分為幾十或更多的等級(jí)，這是人眼所不及的。因此，某些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，如果用光學(xué)顯微鏡作一般的觀察，似乎實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組無(wú)明顯差異，而用圖像灰度法經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，則可反映出顯著性差異，說(shuō)明僅僅用顯微鏡觀察是不夠的，在某些情況下可能會(huì)辜負(fù)了制片過(guò)程中所花費(fèi)的大量精力，而得不到應(yīng)有的結(jié)果。
由于免疫反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)不一定是均勻分布的，在同一個(gè)細(xì)胞中就可產(chǎn)生各種灰度，這種情況如何進(jìn)行比較？有兩類(lèi)方法可供選用：一種是測(cè)每個(gè)細(xì)胞的平均灰度，近年較新型的圖像分析系統(tǒng)有此性能，而比較早期的或比較簡(jiǎn)單的圖像分析系統(tǒng)就沒(méi)有這種性能，例如某一細(xì)胞在電視屏幕上占有120個(gè)像素，按灰度級(jí)進(jìn)行測(cè)量后，也許120個(gè)像素中有十多種不同的灰度，分析儀可立即顯示其平均灰度。另一種方法是在反應(yīng)產(chǎn)物不均勻的細(xì)胞中可用每一種灰度所占的百分率來(lái)表示，例如你要觀察1000個(gè)細(xì)胞，在這些細(xì)胞中各種灰度所占的百分率可測(cè)出，并作出曲線，或用其他統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理，來(lái)進(jìn)行比較。
如果用彩色圖像分析儀，除了上述的灰度測(cè)量以外，還可以將不同的灰度編成不同的顏色，使圖像更鮮明美麗，而且便于測(cè)量。彩色有兩種情況：在屏幕上出現(xiàn)與標(biāo)本一樣的顏色稱為真色（real color)，如果將不同的灰度轉(zhuǎn)換成不同的顏色則稱為假色（pseudo color)，應(yīng)用假色的目的是增強(qiáng)對(duì)比度，來(lái)改善對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的視覺(jué)識(shí)別，同時(shí)可增強(qiáng)輪廓用來(lái)強(qiáng)調(diào)結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié) 。例如，免疫細(xì)胞化學(xué)中常用的非標(biāo)記抗體過(guò)氧化物酶—抗過(guò)氧化物酶法，最終反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色，假設(shè)在腦內(nèi)某核團(tuán)的許多細(xì)胞中，呈現(xiàn)出不同深度的棕色，深淺差別較大者顯示在屏幕上人眼還能區(qū)別，若差別小的則不易區(qū)別了，操作者可將灰度11～15用紅色顯示，灰度16～20用藍(lán)色顯示、灰度21～25用黃色顯示、灰度26～30用綠色顯示等。一般可呈現(xiàn)數(shù)十種顏色。也可以將灰度11～20用深紅色顯示、灰度21～30用淡紅色顯示、灰度31～40用藍(lán)色顯示等，由操作者隨心所欲加以編輯。這種圖像如拍攝下來(lái)，旁邊顯示出一條彩色帶，表明什么顏色代表什么范圍的灰度，如此可將一種顏色的免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本轉(zhuǎn)換成多種彩色的，對(duì)比鮮明的照片。
有些圖像分析儀中帶有光密度計(jì)組件，光密度計(jì)能將掃描器視頻信號(hào)變換成對(duì)數(shù)等值，然后數(shù)值化，就能用絕對(duì)光密度單位來(lái)校正。因此，光密度計(jì)把被測(cè)物的積分光密度作為主要輸出，所謂積分光密度即各個(gè)單獨(dú)探測(cè)的像素密度分布的總和。因?yàn)槿菀椎玫奖粶y(cè)物的面積，也就很容易求出平均密度。光密度在細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的定量領(lǐng)域內(nèi)極為有用�；叶仁且环N相對(duì)值，因?yàn)槟憧蓪?biāo)本上的灰度隨你編輯分為64級(jí)、也可將其分為128級(jí)或者256組，而光密度是絕對(duì)值。在文獻(xiàn)中光密度常用OD表示（optical density)。有的單位購(gòu)置了圖像分析儀后才發(fā)現(xiàn)不能作光密度測(cè)量，但已無(wú)法再去掉換，所以在購(gòu)買(mǎi)前必須詳細(xì)了解其性能，包括屏幕像素?cái)?shù)、有無(wú)光密度計(jì)組件等。
（二)長(zhǎng)度
形狀不規(guī)則的線形組織結(jié)構(gòu)，一般方法很難計(jì)算出其長(zhǎng)度，如組織中的毛細(xì)血管，神經(jīng)纖維、細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中的各種膜性結(jié)構(gòu)等，以往常用排列稀疏或密度集等詞描述，圖像分析儀則可測(cè)出各種圖像周界線的長(zhǎng)度。例如：在活檢組織的子宮頸上皮細(xì)胞的電子顯微鏡照片上，測(cè)出在一定范圍的細(xì)胞膜長(zhǎng)度為8128像素，橋粒長(zhǎng)度為1229像素，計(jì)算出橋粒長(zhǎng)度占細(xì)胞膜總長(zhǎng)度的15%，wiernik等用此方法觀察到癌細(xì)胞的橋粒值遠(yuǎn)小于正常細(xì)胞，提出這可能與癌細(xì)胞易于失去相互間的的細(xì)胞連接，從而形成轉(zhuǎn)移有關(guān)。用免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示的神經(jīng)纖維，在局部組織中可能出現(xiàn)縱橫交錯(cuò)的復(fù)雜圖像，用圖像分析儀可獲得單位面積內(nèi)神經(jīng)纖維的總長(zhǎng)度。又如去甲腎上腺素神經(jīng)纖維呈串珠樣，如果測(cè)出一定范圍內(nèi)神經(jīng)纖維總長(zhǎng)度及局部膨大數(shù)目，即可計(jì)算出串珠平均間隔距離，比較精確。
（三)面積
無(wú)論是在光鏡或電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本的觀察中，都要涉及有關(guān)標(biāo)本中某些結(jié)構(gòu)的面積問(wèn)題。即使是極不規(guī)整的結(jié)構(gòu)，用圖像分析法容易算出其面積。在一定的放大倍數(shù)下，每μm2中含多少像素可以測(cè)出，畫(huà)出待測(cè)結(jié)構(gòu)的輪廓，在所勾畫(huà)的范圍內(nèi)含多少像素是立即可顯示出來(lái)的，這樣，很快可算出面積的數(shù)值。例如免疫電鏡技術(shù)中的鐵蛋白法、膠體金法等，可用上述方法進(jìn)行單位面積中反應(yīng)產(chǎn)物顆粒的計(jì)數(shù)，可進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)條件的比較。
曾有人在肝臟切片上進(jìn)行圖像分析，在一定范圍內(nèi)所有細(xì)胞核的總面積顯示為51554像素，其中肝細(xì)胞核總面積為27431像素，可知肝細(xì)胞核占全部細(xì)胞核總面積的53%。
四、圖像分析儀工作程序
使用者對(duì)硬件不需操縱，它們可完成復(fù)雜的運(yùn)行過(guò)程，完整的計(jì)算機(jī)軟件可按實(shí)際需要使其執(zhí)行功能。對(duì)操作者來(lái)說(shuō)，圖像分析儀的實(shí)際操作很少，幾乎完全是通過(guò)一個(gè)稱為光電鼠標(biāo)（mouse)的附件來(lái)操縱的。計(jì)算機(jī)屏幕上顯示出多項(xiàng)指令，可由光電鼠標(biāo)來(lái)指明你所需要的程序，光電鼠標(biāo)可控制計(jì)算機(jī)屏幕上的一個(gè)光標(biāo)，移動(dòng)光電鼠標(biāo)也隨著移動(dòng)，將光標(biāo)移到計(jì)算機(jī)屏幕上顯示的某項(xiàng)功能的區(qū)域內(nèi)，就表示選擇了該項(xiàng)功能，可以開(kāi)始工作，極簡(jiǎn)便。圖9-1為圖像分析儀的簡(jiǎn)化圖。
圖像分析儀主要包括輸入（input)、中央信息處理機(jī)（central processor)和輸出（output)三大部分。實(shí)際上，工作程序并不是一成不變的，后面的步驟的信息常會(huì)反饋到前面，于是又重復(fù)前面的程序，具體步驟如下：
1．標(biāo)本成像 移動(dòng)標(biāo)本使需要觀察的部位在電視攝像機(jī)上得到適當(dāng)放大的圖像，標(biāo)本包括組織切片或電鏡照片或照相底片等。
2．圖像獲取 用電視攝像機(jī)或其他方法將圖像轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)，在此過(guò)程中，攝像機(jī)的性能極重要，不能使用那些便宜的適用于監(jiān)視的電視攝像機(jī)，一定要用使圖像具有很好的清晰度的攝像機(jī)。
3．加強(qiáng)圖像 加強(qiáng)電子圖像（electronic image)使其更適合于分析。
4．檢測(cè)檢測(cè)（detection )是圖像分析過(guò)程中設(shè)法從圖像中確定并且分離出需要分析灰度相的步驟，“相（phase)”是圖像中我們想要測(cè)量的部分的總稱。檢測(cè)是通過(guò)選擇一定的閾值來(lái)完成的，如果所需相比背景暗，那么所有暗于下限的東西都被選，例如相的灰度是20～50，20是下限，50是上限，背景的灰度小于20，檢定時(shí)暗于灰度20的東西都被選。如果所需相比背景亮，如免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)的標(biāo)本，那么亮于上限的東西都被選。如果所需相比背景亮，如免疫熒光化學(xué)技術(shù)的標(biāo)本，那么亮于上限的東西都被選，例如相的灰度是5～20，5是下限，20是上限，背景灰度大于20，所謂上限既指比灰度20淺的亦即灰度20以下的相被選，而背景是暗于上限的，不被選作測(cè)量。如果相暗于圖像某些部分而又亮于圖像的另一些部分，那就要在二限之間的部分選擇灰度了。
在檢測(cè)過(guò)程中要使用圖像框（image frame)和測(cè)量框（measurement frame)。檢測(cè)只在圖像框內(nèi)進(jìn)行，框的大小按需要而定，測(cè)量框在圖像之內(nèi)，是進(jìn)行測(cè)量的部位。兩個(gè)框之間的部分稱為保險(xiǎn)區(qū)（圖9-2)。
圖像中每個(gè)被測(cè)物都有其特有的特征計(jì)算點(diǎn)（feature count point, FCP),FCP在被測(cè)物的最底點(diǎn)，如圖9-2中上面10個(gè)被測(cè)物的FCP均在測(cè)量框內(nèi)，可計(jì)數(shù)或作其他測(cè)量，而最下面2個(gè)被測(cè)物的FCP不在測(cè)量框內(nèi)，則不計(jì)在內(nèi)，在測(cè)其他區(qū)域時(shí)再計(jì)算，有的被測(cè)可能被測(cè)量框截?cái)啵敲礈y(cè)量框外的那部分被測(cè)物應(yīng)該位于保險(xiǎn)區(qū)，即保險(xiǎn)區(qū)要大于被測(cè)物，才能觀察FCP是否在測(cè)量框內(nèi)而決定取舍。這樣當(dāng)換到相鄰的區(qū)域進(jìn)行測(cè)量時(shí)，不會(huì)使某圖形重復(fù)測(cè)量，可避免測(cè)量誤差，圖9-3顯示放置標(biāo)本的顯微鏡載物臺(tái)的移動(dòng)方式，可由計(jì)算機(jī)控制，用編制好的程序，使載物臺(tái)按一定方式移動(dòng)，也可以人工操作。圖中可以看出每個(gè)部位都將通過(guò)測(cè)量框，不會(huì)遺漏。
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圖9-2 示測(cè)量框位置，圖中有10個(gè)被測(cè)物的FCP在測(cè)量框內(nèi)
5．陰影校正校正圖像細(xì)節(jié) 直到正確無(wú)誤并達(dá)到能被測(cè)量的要求。所謂陰影（shading)是指人眼看來(lái)是均勻的視場(chǎng)內(nèi)存在著不均勻的電子反應(yīng)，這使得灰度相同的圖像成分由于在視場(chǎng)中所處位置不同而顯示出不同的灰度，這種影響必須校正才能使圖像得到準(zhǔn)確測(cè)量。陰影有三個(gè)主要的來(lái)源：
（1)圖像源的不均勻的光照。
（2)穿過(guò)透鏡時(shí)光路發(fā)生變化引起的透鏡陰影。
（3)顯像管本身的圖像靈敏度差異引起的掃描陰影。]
任何圖像分析在具體運(yùn)用中都有這些陰影存在，前二者可通過(guò)精密安裝圖像分析儀來(lái)控制，后者可通過(guò)對(duì)顯像管的質(zhì)量嚴(yán)格篩選來(lái)減少影響。陰影可貯存起來(lái)，并且在每上次掃描時(shí)同步地從圖像信號(hào)中去掉。
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圖9-3 顯微鏡載物臺(tái)移動(dòng)方式
1.載物臺(tái)移動(dòng)方向；2.暈微鏡觀察視場(chǎng)；3.圖像框；4.測(cè)量框
6．測(cè)量經(jīng)以上各步驟后，可以用圖像分析儀的計(jì)算機(jī)對(duì)圖像進(jìn)行測(cè)量來(lái)取得所需的參數(shù)，如灰度、面積、長(zhǎng)度、個(gè)數(shù)等。原始的參數(shù)可由計(jì)算機(jī)轉(zhuǎn)化成容易理解的數(shù)值，例如面積可由某圖形所占像素?cái)?shù)轉(zhuǎn)化為平方微米，使觀察者容易理解。
7．資料分析 將資料進(jìn)行分類(lèi)，并加以說(shuō)明，以便做出結(jié)論。也可將資料貯存，隨意可提取出來(lái)，供研究者使用。
8．其他事項(xiàng)
（1)標(biāo)本要清潔：如果標(biāo)本上有污點(diǎn)，研究者可分辨哪些是正常的免疫反應(yīng)產(chǎn)物，哪些是污染引起的，但儀器不會(huì)區(qū)別，只要是電視屏幕上測(cè)量框內(nèi)有的東西都會(huì)被測(cè)量，如測(cè)灰度時(shí)切片上有污點(diǎn)，會(huì)影響結(jié)果。
（2)電壓要穩(wěn)定：這一點(diǎn)是結(jié)合我國(guó)目前情況而言，雖然儀器使用時(shí)是通過(guò)穩(wěn)壓器的，也要經(jīng)常注意穩(wěn)壓器上的電壓指針是否穩(wěn)定，否則也影響結(jié)果。
（3)價(jià)格問(wèn)題：圖像分析儀廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，因此并不是價(jià)格愈貴就愈好，而要看我們的應(yīng)用目的及其性能，以免購(gòu)置一些用不著的昂貴的附件而造成浪費(fèi)。一般可以從以下三方面來(lái)考察儀器性能：在本專(zhuān)業(yè)范圍內(nèi)應(yīng)用的廣度、運(yùn)算的速度和操作的方便程度。
（4)合作使用：分析儀價(jià)格昂貴，根據(jù)國(guó)內(nèi)目前實(shí)際情況，有些工廠購(gòu)置了圖像儀而僅僅用作工業(yè)金相分析，閑置的時(shí)間很多，我們從事醫(yī)學(xué)研究的人可以去充分利用它的性能，聯(lián)合進(jìn)行科研工作，發(fā)四川省目前最高級(jí)的圖像分析儀就是在工廠中而不是在高等學(xué)校中。
五、沒(méi)有圖像分析儀可否進(jìn)行圖像分析？
當(dāng)沒(méi)有圖像分析儀時(shí)，研究者早已想到用網(wǎng)格來(lái)進(jìn)行圖像分析，也獲得了客觀的評(píng)定結(jié)果。網(wǎng)格可分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是置于目鏡內(nèi)的網(wǎng)格，可測(cè)量切片標(biāo)本上的各種數(shù)據(jù)；另一類(lèi)是大的網(wǎng)格，可放在照片上，光鏡電鏡照片均可用，對(duì)照片上的各種結(jié)構(gòu)可進(jìn)行測(cè)量。以上二者至今仍被采用。英國(guó)標(biāo)線片公司提供許多型號(hào)的市售標(biāo)線片（即網(wǎng)格)。有的國(guó)家制造的顯微鏡，將目鏡與帶有六種不同型號(hào)標(biāo)線片的旋轉(zhuǎn)盤(pán)裝在一起，以便于觀察者作各種測(cè)量。國(guó)內(nèi)某些單位有自制標(biāo)線片，并有少量出售。
Aalto等1982年曾在“免疫組織化學(xué)的形態(tài)測(cè)量法一卵巢腫瘤內(nèi)的胚性癌抗原”一文中推薦用視野評(píng)分法，他用三種方法對(duì)PAP法免疫組化標(biāo)本進(jìn)行分析：①對(duì)全切片的染色進(jìn)行分級(jí)。②在10×10放大倍數(shù)下，每一切片用目鏡網(wǎng)格任選25個(gè)方形視場(chǎng)進(jìn)行觀察，并對(duì)每一視場(chǎng)進(jìn)行分級(jí)。③在25個(gè)視場(chǎng)內(nèi)取25個(gè)點(diǎn)的著色強(qiáng)度進(jìn)行分級(jí)。染色強(qiáng)度分為0級(jí)、1級(jí)（輕度)2級(jí)、（中度)、3級(jí)（重度)。方法①的結(jié)果不同于②③，而方法②和③差別不大，說(shuō)明主觀估算的鑒別能力低，一般鏡下觀察不能確切反映染色強(qiáng)度。
用網(wǎng)格進(jìn)行圖像分析的方法很多，如用免疫熒光等方法顯示神經(jīng)纖維，要表示各處的纖維密度不同，除了文字描述如致密、稀疏等以外，用網(wǎng)格法就要客觀一些，在目鏡或照片上放上網(wǎng)格，觀察陽(yáng)性神經(jīng)纖維與網(wǎng)格上的線條的交叉次數(shù)，排列密集的區(qū)域交叉次數(shù)必然多些，這就比較客觀，重復(fù)性也較好。
用熒光顯微鏡觀察免疫熒光標(biāo)本，Ploem曾在1977年指出熒光強(qiáng)度之差至少要二倍才能在直觀估計(jì)時(shí)顯示出差別，說(shuō)明人視覺(jué)對(duì)熒光強(qiáng)度變化不夠敏感。作者在工作中體會(huì)到，可利用照相的自動(dòng)曝光系統(tǒng)來(lái)作相對(duì)定量，因?yàn)闊晒庥鷱?qiáng)則自動(dòng)曝光時(shí)間愈短，熒光弱則自動(dòng)曝光時(shí)間長(zhǎng)，相當(dāng)敏感，用眼睛觀察二個(gè)熒光強(qiáng)度幾乎無(wú)差別的細(xì)胞，也能在自動(dòng)曝光時(shí)間上顯示出差別來(lái)。作payment-defi.com/pharm/者曾經(jīng)將許多熒光標(biāo)本用相同的曝光時(shí)間拍在同一個(gè)膠卷中，沖洗后，熒光強(qiáng)的區(qū)域膠卷上顯色深，熒光弱的區(qū)域膠卷上顯色淺，因?yàn)闊晒馊菀状銣�，用此法可將膠卷較長(zhǎng)期保存，而且膠卷上的信息還可通過(guò)圖像分析儀測(cè)灰度等數(shù)據(jù)。這些都是在實(shí)踐中的一點(diǎn)經(jīng)驗(yàn)，供讀者參考。
用網(wǎng)格測(cè)量的具體操作舉例：圖9-4為一關(guān)聯(lián)方測(cè)格，由于測(cè)點(diǎn)、測(cè)線、測(cè)面之間有互相關(guān)聯(lián)的關(guān)系，故稱為關(guān)聯(lián)方測(cè)格。方格直線交叉稱為測(cè)點(diǎn)，總數(shù)為100個(gè)，方格中所有直線稱為測(cè)線，小方格邊長(zhǎng)為d如圖中所示，測(cè)線總長(zhǎng)度為200d,整個(gè)大方格為測(cè)面，測(cè)面總面積為100d2，測(cè)格周?chē)奶摼�不是測(cè)線。關(guān)聯(lián)測(cè)格的優(yōu)點(diǎn)是：只在計(jì)數(shù)位于欲測(cè)圖像中的測(cè)點(diǎn)數(shù)P，就可計(jì)算位于該圖像中的測(cè)線長(zhǎng)度L及測(cè)面的面積A。計(jì)算方法為：L=2d·P，A=d2·P。
可將圖9-4攝制于小的透明膠片上，剪成你所用的目鏡筒的內(nèi)徑大小，將其置于目鏡內(nèi)，使測(cè)格清晰地疊映組織標(biāo)本的圖像上，則可進(jìn)行測(cè)量。d的長(zhǎng)度可用臺(tái)微尺來(lái)確定。也可將9-4復(fù)印在較大的透明膠片上，可用來(lái)測(cè)量電鏡照片或光鏡照片，將透明膠片疊加在照片上即可進(jìn)行測(cè)量。圖9-5為一測(cè)量的例子：
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圖9－4 關(guān)聯(lián)方測(cè)格
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圖9-5 示測(cè)點(diǎn)計(jì)數(shù)
此關(guān)聯(lián)方測(cè)格共有測(cè)點(diǎn)100個(gè)（如果只計(jì)數(shù)粗測(cè)點(diǎn)則有25個(gè))，圖像為一個(gè)腎小體的輪廓，包括血管球和腎小囊腔，測(cè)點(diǎn)計(jì)數(shù)的結(jié)果，在腎小囊腔內(nèi)的測(cè)點(diǎn)數(shù)為12，在血管球內(nèi)的測(cè)點(diǎn)為49個(gè)，整個(gè)腎小體內(nèi)的測(cè)點(diǎn)為12+49=61個(gè)，用臺(tái)微尺測(cè)出d的長(zhǎng)度，則可得到此圖像中腎小囊腔的面積，血管球的面積，腎小體的面積。明小囊腔與腎小體的面積比12：61=19.7%等多個(gè)參數(shù)。
值得提出的是，在顯微鏡下網(wǎng)格的線條有一定寬度，如圖9-6所示。計(jì)數(shù)測(cè)點(diǎn)時(shí)如①箭頭所示，即橫線上緣與豎線右緣交點(diǎn)處為真正的測(cè)點(diǎn)，若此點(diǎn)落在圖像外面則不能計(jì)數(shù)。如②箭頭所示，此測(cè)線的上緣才能作為真正的測(cè)線。
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圖9-6 示真正的測(cè)點(diǎn)與測(cè)線
表面積密度的測(cè)定：免疫細(xì)胞化學(xué)電鏡照片中的膜性結(jié)構(gòu)如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、細(xì)胞膜等都可測(cè)定表面積密度，光鏡標(biāo)本中的各種結(jié)構(gòu)也可同樣測(cè)定。表面積密度是指單位體積參照空間內(nèi)特征物的表面積，通過(guò)數(shù)學(xué)運(yùn)算可簡(jiǎn)便地用以下方法測(cè)定：測(cè)量單位面積參照面內(nèi)特征物斷面周界線的長(zhǎng)度。如果某一個(gè)細(xì)胞的電鏡照片作為參照面，線粒體作為特征物，欲測(cè)單位面積電鏡照片內(nèi)線粒體斷面周界線的長(zhǎng)度，可用以下公式：
SV=2IL
SV表面積密度2IL交點(diǎn)密度
IL=測(cè)線與特征物斷面周界線之間的交叉點(diǎn)數(shù)除以參照面內(nèi)測(cè)線總長(zhǎng)度。
圖9-7為一咱擺線測(cè)格，可用來(lái)方便地測(cè)表面積密度。圖中的平行直線不是測(cè)線，僅是為了便于計(jì)數(shù)交叉點(diǎn)和測(cè)點(diǎn)而畫(huà)上的。圖中的曲線即擺線，也就是測(cè)線，共45條，每條擺線長(zhǎng)度d=1/10測(cè)格寬度(1cycloid arc =1/10×frame width) ，測(cè)格的寬度容易測(cè)量，如用目鏡測(cè)格，可用臺(tái)微尺測(cè)量，如用大的透明膠片，可實(shí)際用尺測(cè)量，因此每條擺線長(zhǎng)度很易算出。測(cè)格中共有45條擺線，其總長(zhǎng)為45d。圖中直角短線（L)示測(cè)點(diǎn)，共90個(gè)，測(cè)線長(zhǎng)度L與測(cè)點(diǎn)數(shù)P的關(guān)聯(lián)關(guān)系為L(zhǎng)=d/2·P。具體來(lái)說(shuō)，用圖9-7擺線測(cè)格，置于一個(gè)細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)照片上，如果整個(gè)測(cè)格均位于照片內(nèi)，則參照面內(nèi)測(cè)線總長(zhǎng)度為45d,如果90個(gè)測(cè)點(diǎn)只有60個(gè)落至細(xì)胞內(nèi)（即測(cè)格中有30個(gè)測(cè)點(diǎn)落在此照片外)則參照面內(nèi)的測(cè)線總長(zhǎng)度為d/2·P=d/2×60=30d。擺線與特征物（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、線粒體的膜等)的交叉點(diǎn)容易數(shù)，用上述IL和SV公式即可得出所需參數(shù)。此公式為經(jīng)過(guò)數(shù)學(xué)上的研究而得出，我們可應(yīng)用公式來(lái)作表面積密度的研究。
讀者需注意的是：若特征物是各向同性分布，可采用任意方向的隨機(jī)切片。若特征物呈各向異性分布，可采用垂直切片或其他一些方法制作的切片。Mattfeldt等曾提出在一個(gè)組織塊中作三個(gè)互相垂直的切片（three mutually perpendiculersections )用作研究。目前通用的垂直切片的概念是1986年Baddeley等人提出，指垂直于某任意確定的水平面的隨機(jī)切片，或平行于某一任意確定的垂直軸的隨機(jī)切片。如圖9-8所示，HP為水平面（horizontal plane)，VP為垂直面（vertical planes)，二個(gè)垂直面互相不是平行關(guān)系，成一定角度。在生物組織中，如皮膚的表皮、各種上皮的外表面均可作為水平面，只要與水平面垂直的各個(gè)方向所切的切片均為垂直切片。骨骼肌纖維的長(zhǎng)軸、長(zhǎng)骨的長(zhǎng)軸均可作為垂直軸，與其平行的切片也作為垂直切片。管狀的器官如消化管、呼吸管道等，可縱向剖開(kāi)，展平，當(dāng)作水平面，在其中作垂直切片如圖9-9所示：以水平面為基準(zhǔn)，垂直切片必需在隨機(jī)的位置和隨機(jī)的方向，在標(biāo)本計(jì)劃中，第一步是需要隨機(jī)，常用一組系統(tǒng)隨機(jī)位置的垂直切片（systematic randomly positionedvertical sections)，第一個(gè)切面是隨機(jī)的，其余切面則是與第一個(gè)切面或一定的角度而選擇的，如圖中（3)和（4)即表示三個(gè)不同的方向，但都垂直于同平面，即垂直切片互相間有一定的旋轉(zhuǎn)角度。圖9-7擺線測(cè)格中大箭頭所示vertical 表示箭頭方向與標(biāo)本垂直軸一致，即圖9-8中的verfical 所示方向。
如果有的標(biāo)本沒(méi)有可辨認(rèn)的垂直軸，可任意確定一個(gè)水平面，來(lái)作垂直切片。
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圖9-7 示擺線測(cè)格
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9-8 示垂直切片
VERTICAL：指垂直軸；
P：水平面；二個(gè)VP為垂直面，互相不呈平行關(guān)系
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圖9-9 示管狀器官的垂直切片
六、實(shí)例介紹
因?yàn)閷⒚庖呒?xì)胞化學(xué)方法與圖像分析結(jié)合起來(lái)進(jìn)行研究的論文在國(guó)內(nèi)國(guó)外都還不多。在第六屆國(guó)際學(xué)術(shù)會(huì)議上發(fā)表的90多篇論文中只有1篇，因此在實(shí)例介紹中，包括一部分不是免疫細(xì)胞化學(xué)方法，而是用其他組織學(xué)方法與圖像分析結(jié)合起來(lái)研究，但這種方法對(duì)研究免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本也可借鑒，從中可得到一些啟發(fā)的，也在此選擇性地作一些介紹。
Mcmillan等1983年在第六屆國(guó)際體視學(xué)會(huì)議上曾報(bào)告了“用圖像信息處理機(jī)客觀評(píng)定免疫組織化學(xué)染色的組織”，闡明了當(dāng)組織與第一抗體作用時(shí)，不斷攪動(dòng)血清，明顯提高了免疫反應(yīng)。Bordier 等1982年用圖像分析法對(duì)大鼠的神經(jīng)垂體進(jìn)行研究，闡明了軸突占神經(jīng)垂體體積的一半，分泌顆粒占軸突體積的20%，加壓素的含量與分泌顆粒的體積密度無(wú)關(guān)，而與分泌顆粒內(nèi)激素濃度有關(guān)。這些結(jié)果如不用圖像分析法是很難得出的。Steward等1983年用測(cè)量家雞腦單位面積內(nèi)的突觸數(shù)目等，來(lái)研究與記憶形成有關(guān)的細(xì)胞學(xué)改變。
英國(guó)現(xiàn)在有300萬(wàn)75歲以上的人，其中有五十萬(wàn)人患有老年性癡呆（Alzheimer病)，這種病過(guò)去認(rèn)為是由于年齡增長(zhǎng)的不可避免的現(xiàn)象。英國(guó)神經(jīng)科學(xué)所用圖像分析儀與谷氨酸鹽受體的放射自顯影法結(jié)合起來(lái)對(duì)此病進(jìn)行了重要的研究。由于放射自顯影會(huì)產(chǎn)生一些非特異性的結(jié)合，用圖像分析儀可以從全結(jié)合圖像減去非特異性結(jié)合圖像，而得到特異性結(jié)合圖像，可以測(cè)出特異性結(jié)合的百分率。目前已知道，老年性癡呆患者腦中，與記憶、理性行為及感情行為有關(guān)的區(qū)域內(nèi)，神經(jīng)元的進(jìn)行性退變，神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生改變，影響了從一個(gè)神經(jīng)元到另一個(gè)神經(jīng)元的信息傳遞。
我國(guó)1991年11月出版的“計(jì)量學(xué)在形態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集“共收集論文123篇，其中有關(guān)免疫細(xì)胞化學(xué)與計(jì)量學(xué)結(jié)合的論文共8篇：①大鼠燙傷后下丘腦室旁核和視上核內(nèi)AVP含量變化的形態(tài)學(xué)計(jì)量（第二軍醫(yī)大學(xué)張忠義等)用圖像分析儀測(cè)定AVP陽(yáng)性反應(yīng)物的面積。②人脊神經(jīng)節(jié) 內(nèi)SP、SK、CGRP免疫反應(yīng)細(xì)胞的比率（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)方秀斌等)，用人工計(jì)數(shù)方法。③交感神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元中ACh和ChAT顯示比較（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院汪家政等)，用圖像分析法測(cè)定各種參數(shù)。④大鼠脾樹(shù)狀突細(xì)胞的組織分布棗S—100蛋白標(biāo)記和立體計(jì)量分析（南京鐵道醫(yī)學(xué)院張錦堃等)用目鏡標(biāo)線片的測(cè)格進(jìn)行定量研究。⑤垂體GH腺瘤細(xì)胞分泌顆粒的免疫膠體金定位檢測(cè)及定量分析（中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院羅毅等)，用圖像分析法測(cè)定各種參數(shù)。⑥胃腸粘膜重度異型增生與腺癌細(xì)胞核DNA含量的測(cè)定及免疫組化的比較研究（上海第二醫(yī)科大學(xué)吳平平等)，用顯微分光光度系統(tǒng)進(jìn)行DNA測(cè)量。⑦免疫組化在胃癌病理?xiàng)椛飳W(xué)分型中的價(jià)值（濱州醫(yī)學(xué)院張樹(shù)畢等)，將免疫組化反應(yīng)分為陽(yáng)性陰性而進(jìn)行比較。⑧人胎十二指腸EC細(xì)胞的體視學(xué)研究（江西醫(yī)學(xué)院朱清仙等)用目鏡標(biāo)線片測(cè)格進(jìn)行定量研究。由此可大致體現(xiàn)我國(guó)在此領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀。
七、圖像分析與體視學(xué)
圖像分析還可用于三維重建，用連續(xù)切片可重建立體的原形，在神經(jīng)組織的研究中很適用。我們?cè)陲@微鏡下觀察到的是平面圖像，而這些平面圖像是從立體結(jié)構(gòu)中切下來(lái)的，單憑平面圖像不能反映組織的真實(shí)結(jié)構(gòu)，例如圓形可以從球形、圓柱形、橢圓形物體中切下。如何從二維結(jié)構(gòu)推導(dǎo)出三維結(jié)構(gòu)，這就是所謂體視學(xué)（stereology)所研究的范疇。stereology 這個(gè)詞是1961年開(kāi)始正式應(yīng)用的，由于體視學(xué)與圖像分析的密切關(guān)系，無(wú)論是國(guó)際上的或國(guó)內(nèi)的學(xué)術(shù)會(huì)議都將這二者放在一起討論。
將體視學(xué)知識(shí)與免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本觀察聯(lián)系起來(lái)，將是一種可以獲取更多信息的研究手段，目前國(guó)外已很重視體視學(xué)的研究方法，發(fā)表了一些論文，國(guó)內(nèi)也開(kāi)始做這方面的工作，因此有必要將體視學(xué)的一些基本術(shù)語(yǔ)介紹給讀者，供參閱文獻(xiàn)時(shí)或自己進(jìn)行研究時(shí)應(yīng)用。體視學(xué)語(yǔ)言目前已是一種通用的術(shù)語(yǔ)，現(xiàn)將常用的介紹如下：
結(jié)構(gòu)（structure)：在一個(gè)確定的組織模式中，由許多相互依賴的部分所組成的某物體稱為結(jié)構(gòu)。一個(gè)結(jié)構(gòu)至少有二個(gè)組分構(gòu)成，體視學(xué)的目的即弄清楚各組分之間相互關(guān)聯(lián)程度、相對(duì)大小等。
組分（component)：在結(jié)構(gòu)中能被截然分開(kāi)而且能被辨認(rèn)的部分。
相（phase)：所有在本質(zhì)上相同的組分的集合稱為相。例如一個(gè)細(xì)胞的所有線粒體構(gòu)成了此細(xì)胞的線粒體相。
粒子（partiele)：假如組分是由許多離散的并且能夠作為單元獨(dú)立存在的要素所組成，則將這些要素稱為粒子，粒子可以表現(xiàn)為各種形狀。
凸面體（convex solid)：連接此實(shí)體內(nèi)任何兩點(diǎn)的線段，必需全部落于此實(shí)體內(nèi)，換句話說(shuō)，即此實(shí)體上切下的一個(gè)切片只能形成一個(gè)截面。
包容空間（containing space)：指包含被研究的組分的空間。當(dāng)然，被研究的組分常與其他不被研究的組分并存。
密度（density)：?jiǎn)挝惑w積、單位面積或單位長(zhǎng)度內(nèi)的量。
體積密度（volume density)：在單位包容空間內(nèi)，某相的體積。
表面積密度（surface density)：?jiǎn)挝话菘臻g內(nèi)所含有某相的表面積。
長(zhǎng)度密度（length density)：?jiǎn)挝话菘臻g內(nèi)某相的長(zhǎng)度。
數(shù)密度(numerical density)：?jiǎn)挝话菘臻g內(nèi)某相的數(shù)目。
截面（profile)：任何結(jié)構(gòu)的切片上的圖像。
體視學(xué)的測(cè)量值往往是相對(duì)測(cè)量值，以兩個(gè)彼此相關(guān)聯(lián)的測(cè)量值的比率來(lái)表達(dá)，其中一個(gè)測(cè)量值與組分有關(guān)，另一個(gè)測(cè)量值與包容空間在關(guān)，后者也稱為“參考系統(tǒng)”。體視學(xué)原理可確定在切片上測(cè)得的這些比率與空間結(jié)構(gòu)內(nèi)相應(yīng)的比率之間的精確關(guān)系。上述性質(zhì)反映在體視學(xué)符號(hào)中，而這些符號(hào)目前已普遍被使用，在有些文獻(xiàn)中已不再作解釋了。常用的符號(hào)如下：
P測(cè)試點(diǎn)數(shù)
P1單位測(cè)試線長(zhǎng)上的交點(diǎn)數(shù)
Pa單位測(cè)試面積上的點(diǎn)數(shù)
Pv單位測(cè)試體積上的點(diǎn)數(shù)
L測(cè)試線長(zhǎng)
L1單位測(cè)試線長(zhǎng)上的截距
La單位測(cè)試面積上線的單元長(zhǎng)
Lv單位測(cè)試體積上線的單元長(zhǎng)
A測(cè)試面積
S表面積
Aa單位測(cè)試面積上被測(cè)物的面積
Sv單位測(cè)試體積內(nèi)被測(cè)物的表面積
V體積
Vv單位測(cè)試體積內(nèi)被測(cè)物的體積
N被測(cè)物數(shù)目
N1 單位測(cè)試線長(zhǎng)上與被測(cè)物相交的數(shù)
NA單位測(cè)試線長(zhǎng)上與被測(cè)物的數(shù)
Nv單位測(cè)試體積內(nèi)被測(cè)物的數(shù)
用測(cè)試網(wǎng)格的體視學(xué)方法，楊光等，1987年曾對(duì)腹腔神經(jīng)節(jié) 小強(qiáng)熒光細(xì)胞進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)的定量分析，測(cè)量了線粒體、溶酶體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、顆粒小泡的Vv、Sv、Na、Nv等參數(shù)，得出了標(biāo)準(zhǔn)小強(qiáng)熒光細(xì)胞的計(jì)量值。此處的Vv即單位體積細(xì)胞質(zhì)內(nèi)某種細(xì)胞器的體積，據(jù)體視學(xué)原理，Vv等于切片上被測(cè)的某種細(xì)胞器所占的面積的均數(shù)a與細(xì)胞質(zhì)的面積的均數(shù)A之比，如用圖像分析儀即可得出此二者的面積，而用測(cè)試格a等于落在此細(xì)胞器上的測(cè)試格的交點(diǎn)總數(shù)∑Pi，A等于落在細(xì)胞質(zhì)上的測(cè)試格交點(diǎn)總數(shù)∑Pc。
Vv=ā／A=∑Pi/∑Pc
測(cè)試格的交點(diǎn)數(shù)有各種規(guī)格，如果有20條橫測(cè)試線與20條縱測(cè)試線組成的測(cè)試網(wǎng)格，則有400個(gè)交點(diǎn)，利用交點(diǎn)所落部位進(jìn)行推算。
免疫組織化學(xué)形態(tài)計(jì)量研究中參照空間的“陷井”問(wèn)題。在某種組織結(jié)構(gòu)（參照空間)內(nèi)測(cè)量特征物的密度值（如體積分?jǐn)?shù)、表面積密度、長(zhǎng)度密度、數(shù)目密度等)，如果不知道參照空間的體積，得不到絕對(duì)值，就有可能作出錯(cuò)誤的結(jié)論，就是參照空間的“陷井”。舉一例子說(shuō)明：實(shí)驗(yàn)的結(jié)果苯巴比妥對(duì)大鼠肝細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的體積分?jǐn)?shù)和表面積密度無(wú)顯著差異，如果依此就認(rèn)為苯巴妥對(duì)肝細(xì)胞（參照空間)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無(wú)顯著影響，就錯(cuò)了，就進(jìn)入了參照空間的“陷井”中去了。實(shí)際上，在些實(shí)驗(yàn)條件下，肝細(xì)胞質(zhì)總體積顯著增加，因而雖然內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的體積分?jǐn)?shù)和表面積密度無(wú)顯著差異，但其絕對(duì)值已顯著增加了。因此，要測(cè)量或估計(jì)參照空間的體積、乘以密度值，獲得絕對(duì)值，才能獲正確的結(jié)論。
八、國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)圖像分析儀的情況簡(jiǎn)介
（一)國(guó)內(nèi)情況
80年代初，以IBM—PC為代表的個(gè)人計(jì)算機(jī)得到了突飛猛進(jìn)的大發(fā)展和在普及；緊接著各種功能強(qiáng)大面向圖像處理與分析的專(zhuān)用超大規(guī)模（VLSI)蕊片或單板達(dá)到商品化水平，兩者的結(jié)合，為微機(jī)圖像處理系統(tǒng)的問(wèn)世奠定了硬件基礎(chǔ)。打破了以往只能在大中型計(jì)算機(jī)加專(zhuān)用圖像處理系統(tǒng)的構(gòu)成價(jià)格昂貴的圖像處理系統(tǒng)的局面。為推廣圖像處理與分析技術(shù)創(chuàng)造了物質(zhì)基礎(chǔ)。從80年代中期開(kāi)始，國(guó)內(nèi)先后有武漢大學(xué)、清華大學(xué)、中科院自動(dòng)化所、計(jì)算所、重慶大學(xué)、四川大學(xué)、華北計(jì)算所等單位，紛紛進(jìn)行微機(jī)圖像處理與分析系統(tǒng)的研制和推廣應(yīng)用工作。其中以四川大學(xué)計(jì)算機(jī)系圖像圖形研究所研制開(kāi)發(fā)并定型生產(chǎn)的MIAS系列圖像分析儀在國(guó)內(nèi)具有較大的優(yōu)勢(shì)，獲得了1992年國(guó)家級(jí)新產(chǎn)品證書(shū)。
現(xiàn)介紹如下：MIAS系列圖像分析儀包括偽彩色型MIAS—300，真彩色型MIAS—400，超高分辨率型MIAS—1000等面向生物醫(yī)學(xué)、金相分析、石油地質(zhì)以及其它專(zhuān)用目的的各種圖像儀均由硬件系統(tǒng)和軟件系統(tǒng)兩大部分構(gòu)成。硬件系統(tǒng)主要包括MIAS圖像處理計(jì)算機(jī)、圖像輸入設(shè)備，圖像輸出設(shè)備和交互式處理設(shè)備等。其主要性能指標(biāo)：圖像分辨率512×512，640×480，1280×1024。圖像采集速度：電視方式0.04s/幀，慢速高精方式2～10秒/幀。圖像存儲(chǔ)體：MIAS—3000.5MB～1.5MB（兆字節(jié) )，MIAS—4001.5MB～4.5MB,MIAS—1000 2MB～10MB �；叶鹊燃�(jí)：256或4096。專(zhuān)用圖像處理器特性：IPU40MHZ主頻，>10MIPS。IFU（圖像浮點(diǎn)處理器)40MHZ主頻，>4MFOPS（每秒兆浮點(diǎn)處理指令)。在各種圖像輸入設(shè)備中，以視頻攝像機(jī)為圖像的基本輸入設(shè)備，也可以配接視頻錄像機(jī)、數(shù)字掃描儀和連接掃描電鏡的專(zhuān)用接口。高分辯彩色監(jiān)示器為圖像的基本輸出設(shè)備。該系統(tǒng)還具備有自動(dòng)移位的載物臺(tái)和自動(dòng)聚集控制系統(tǒng)可供用戶選擇。MIAS系列圖像分析儀的軟件系統(tǒng)是在DOS（磁盤(pán)操作系統(tǒng))3.2以上環(huán)境開(kāi)發(fā)的，全部采用C語(yǔ)言和匯編語(yǔ)言（80286宏匯編，TMS340系列專(zhuān)用匯編)進(jìn)行編程，共98個(gè)功能模塊。主要功能包括初始化及環(huán)境設(shè)置、圖像輸入和輸出、圖像編輯、圖像增強(qiáng)、圖像分割、圖像測(cè)量、實(shí)用程序等。測(cè)量參數(shù)包括一維和二維目標(biāo)的各種形態(tài)參數(shù)，灰度參數(shù)和紋理參數(shù)等數(shù)十種。該系統(tǒng)在長(zhǎng)期為華西醫(yī)科大學(xué)、第一和第四軍醫(yī)大學(xué)、北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、上海醫(yī)科大學(xué)、湖南醫(yī)學(xué)院、哈爾濱醫(yī)科大學(xué)等數(shù)十個(gè)醫(yī)學(xué)單位的服務(wù)中，積累了許多有效的實(shí)用算法和功能、用戶界面和處理速度方面已達(dá)到和超過(guò)某些進(jìn)口中高檔圖像儀的水平。
（二)國(guó)外情況
英國(guó)的主要生產(chǎn)廠家有劍橋儀器公司（Cambridge Instruments Company)，在圖像的測(cè)量、計(jì)算、比較、分類(lèi)等功能上都比過(guò)去的產(chǎn)品更完善，使用了大功率的新型計(jì)算機(jī)，使用QUIPS程序可獲得各種圖像分析測(cè)量的數(shù)據(jù)，重現(xiàn)性好。操作者不必精通程序設(shè)計(jì)語(yǔ)言，只需接受幾小時(shí)使用QUIPS語(yǔ)言的教學(xué)訓(xùn)練即可。
英國(guó)Ealing—Beck公司生產(chǎn)Histotrak圖像分析系統(tǒng)，如用透射光，該儀器能自動(dòng)改變放大倍數(shù)。具有陰影校正系統(tǒng)。最使研究工作者感興趣的是該儀器中設(shè)有坐標(biāo)發(fā)生器，能使被檢圖像的坐標(biāo)數(shù)據(jù)通過(guò)臺(tái)式計(jì)算機(jī)在輸出打印機(jī)上打印出來(lái)。
英國(guó)Micro Measurements 公司生產(chǎn)電視掃描圖像分析儀，成本較低，用途較多。
英國(guó)Joycez—Loebl公司生產(chǎn)Magiscam圖像分析系統(tǒng)，操作較簡(jiǎn)單，可解決一般圖像分析問(wèn)題，并可進(jìn)行彩色圖像分析，在醫(yī)學(xué)和放射學(xué)等方面適用。
美國(guó)的主要廠家有美國(guó)美敦設(shè)備公司（Milton Roy Company)，生產(chǎn)OMNICON圖像分析儀，據(jù)上海多國(guó)儀器儀表展覽會(huì)資料介紹，Ommicon圖像分析系統(tǒng)有Omnicon Alpha500用于常規(guī)檢驗(yàn)和研究。Ommicon FAS—III 用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域較合適。Omnicon 3500為一種多用途的系統(tǒng)，配有64K通用NOVA4×計(jì)算機(jī)。Omnicon 5000是該公司發(fā)展的使用起來(lái)最方便的定量圖像分析儀。Omnicon 7500是為了對(duì)圖像作實(shí)時(shí)分析而設(shè)計(jì)的產(chǎn)品。
德國(guó)Leitz公司制造Leitz T.A.S圖像分析儀，圖像輸入裝置是一臺(tái)Leitz Orthplan顯微鏡，該儀器還包括一臺(tái)TU—58雙盒式磁帶機(jī)，可用于存貯程序、數(shù)據(jù)、圖像。該公司產(chǎn)品的新型號(hào)是Leitz T.A.S PLUS，增加了自動(dòng)調(diào)焦、自動(dòng)圖像旋轉(zhuǎn)等功能。
德國(guó)Carl Zeiss公司的產(chǎn)品是Micro—Videomat，主要優(yōu)點(diǎn)是有適用于計(jì)算機(jī)和大型計(jì)算機(jī)的程序。型號(hào)有Micro Videomat 2型、3型等。
德國(guó)的OPTON公司生產(chǎn)IBAS2000圖像分析系統(tǒng)，可應(yīng)用于顯微圖像分析的所有領(lǐng)域，如放射自顯影、染色體分析、真色圖像信息、細(xì)胞學(xué)分析、用連續(xù)切片來(lái)重建原形、顆粒大小分析、纖維分析、可測(cè)定交叉的或重疊的纖維長(zhǎng)度及纖維的長(zhǎng)/寬比例等。
德國(guó)VEB Zeiss Jena公司生產(chǎn)EPIQUANT圖像分析儀，可進(jìn)行自動(dòng)或半自動(dòng)分析。
日本浜板電視公司生產(chǎn)一系列特殊用途的、測(cè)量特殊參數(shù)的自動(dòng)分析系統(tǒng)，如其中有一種稱為Multianalyser的，與顯微鏡相結(jié)合，可用來(lái)測(cè)面積、長(zhǎng)度等。
對(duì)國(guó)內(nèi)外資料收集比較局限，總之購(gòu)置儀器時(shí)要充分了解性能、對(duì)價(jià)格作比較、才能獲得滿意的結(jié)果。
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