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您現(xiàn)在的位置: 醫(yī)學(xué)全在線 > 理論教學(xué) > 基礎(chǔ)學(xué)科 > 免疫細(xì)胞與核酸分子雜交 > 正文:DNA及寡核苷酸探針在原位雜交組織化學(xué)中的應(yīng)用
    

DNA及寡核苷酸探針在原位雜交組織化學(xué)中的應(yīng)用

  一、DNA探針的應(yīng)用

  雖然一般認(rèn)為DNA探針敏感度不如cRNA探針,但在病毒的檢測等領(lǐng)域中DNA探針仍得到廣泛的應(yīng)用。

  在原位雜交細(xì)胞化學(xué)的操作步驟方面與cRNA探針基本相同,所不同的是:(1)雜交時需先在高溫80~95℃短時處理,使DNA探針及細(xì)胞內(nèi)靶DNA變性,解離成單鏈,迅置于冰上冷卻。然后置于37℃~42℃雜交過夜。(2)RNA酶的溶液的沖洗不能減低背景,因此,在操作步驟中省略此步。

 。ㄒ)地高辛-堿性磷酸酶(Dig -AKP)標(biāo)記DNA探針在石蠟包埋切片檢測病毒DNA中的應(yīng)用

  1.組織前處理

 。1)固定:組織以10%中性福爾馬林液或Bouins液固定,常規(guī)石蠟包埋,切片厚4~6μm,粘附于涂有粘附劑的玻片上,入烤箱60~80℃6~8h,使切片更緊貼玻片。

 。2)脫蠟:二甲苯10min ×2,自100%乙醇,90%,70%,50%,30%各5min。入PBS(含5mmol/l MgCl2,pH7.3~7.4)10min×2。入0.2n HCl 20min以進(jìn)一步去除蛋白。

 。3)50℃2×SSC,含5mmol/l EDTA溶液中30min。

 。4)蛋白酶K(1μg/ml溶于0.1mol/l PBS中,)37℃20~25min。

 。5)0.2mol/l 甘氨酸液:室溫10min,中止蛋白酶反應(yīng)。

 。6)4%多聚甲醛(PBS新鮮配制):室溫20min。

 。7)PBS/5mmol/l MgCl2漂洗10min×2。

 。8)脫水,自低濃度到高濃度,無水乙醇各3min,空氣干燥。

  2.預(yù)雜交封閉非特異性雜交位點(diǎn),20μl/每張切片,42℃水浴半小時。

  3.雜交10~20μl/每張切片,加蓋硅化蓋玻片,將切片置于95℃min,使探針及病毒DNA變性,然后迅速置于冰上1min(也有報告用乙醇使之冷卻的),然后將切片置于盛有2×SSC濕盒內(nèi),42℃過夜(16~18h)。

  4.雜交后漂洗

 。1)2×SSC液內(nèi)振動移除蓋片。

 。2)2×SSc 55℃10min×2。

 。3)0.5×SSc 55℃5min×2。

  (4)緩沖液II(含0.5%封阻試劑,用緩沖液I溶解)37℃30min。

 。5)緩沖液I(10mmol/l Tris –HCl, 15.0mmol/L NaCl pH7.5)15min,室溫。

 。6)酶標(biāo)地高辛抗體(1:5000,應(yīng)用緩沖液I稀釋)37℃30min。

 。7)緩沖液i 15min×2室溫。

 。8)緩沖液III(100mmol/l Tris -HCl, 100mmol/L NaCl, 50mmol/L MgCl2,pH9.5)室溫2min。

  5.顯色

 。1)顯色液配制:緩沖液III:1ml中加入4.5μl四氮唑藍(lán)(NBT),3.5μl X-磷酸鹽(5-溴-4-氯-3吲哚磷酸鹽(BCIP配成))。30μl/每張切片,置暗處顯色30min到2h。定時抽查切片,鏡檢其顯色情況。醫(yī)學(xué).全在.線www.med126.com

 。2)緩沖IV(10mmol/l Tris –HCl, 1mmol/L EDTA, pH8.0)10min終止反應(yīng),甲綠復(fù)染5min,二甲苯透明,DPX封固,鏡檢。

 。ǘ)熒光標(biāo)記DNA探針的應(yīng)用

  1.概述在原位雜交細(xì)胞化學(xué)中熒光標(biāo)記DNA探針(Fluorescence in situ DNA hybridisa-tion , FISH)的應(yīng)用在細(xì)胞培養(yǎng)和染色體鋪片(見二十一章 )中較為廣泛。FISH屬于非放射性標(biāo)記,其優(yōu)點(diǎn)在于簡便,快速,其敏感性可與放射性同位素標(biāo)記核酸探針相等。不少實(shí)驗(yàn)室報告應(yīng)用FISH(2~5kbp探針)可成功地達(dá)到單個拷貝(copy)的特異性定位。

  2.熒光標(biāo)記DNA探針應(yīng)用于ISHH中的基本原則(Barbara Traok和Dan Pinkel 1990)

 。1)首先應(yīng)使組織或染色體中靶核苷酸高溫加熱變性解離為單鏈DNA,化學(xué)性標(biāo)記的DNA探針除外。

 。2)雜交:一般在37℃進(jìn)行,探針稀釋濃度在2ng/μl,染色體鋪片探針濃度在0.4ng/μl,雜交液2~3μl/每cm2蓋片,每張蓋片大約1.8cm2,約需10μl雜交液。有實(shí)驗(yàn)室報告,如每張蓋片(溫度為室溫)加入雜交液將會降低雜交溫度所需要的37℃,因此,建議對蓋片應(yīng)用前在37℃進(jìn)行預(yù)熱。

  (3)用免疫細(xì)胞化學(xué)或組織化學(xué)方法顯示熒光標(biāo)記。自80年代以來,熒光素標(biāo)記檢測系統(tǒng)日益增加。包括:①生物素標(biāo)記探針與熒光素標(biāo)記的抗生物素(avidin)或抗生物素抗體。②氨乙;鶡晒猓╝minoacetylfluroence,AAF)-改良探針(modified probe),與抗AAF抗血清。③磺酸(sulfonatc)改良探針,以抗磺酸抗血清檢測(Organic Ltd, Yavene, Israel和TMc Bioproducts Rockland ME可提供此藥盒)。④汞標(biāo)記探針(mercurated probe),以硫氫基(sulf hydryl)與熒光標(biāo)記物或-半抗原相結(jié)合,再以抗半抗原抗血清檢測。⑤地高辛標(biāo)記探針,以地高辛抗血清檢測(Boehringer – Manubeim Inc, Mannhein, FRG可提供此藥盒)。在上述各例中,為簡便可采用直接法(圖20-4A),為提高敏感度可采用間接法(圖20-4B)。

圖20-4 生物素標(biāo)記核酸探針熒光免疫反應(yīng)圖解

  生物素和地高辛用缺口平移法或隨機(jī)引物法進(jìn)行標(biāo)記,以用后者為多。氨乙酰熒光素,磺酸和汞的核苷酸探針標(biāo)記利用簡單的化學(xué)反應(yīng)。產(chǎn)生熒光的物質(zhì)各有不同,常用的有異硫氰酸熒光素(FITC),也有應(yīng)用德克薩斯紅(texaored)獲得滿意效果的。但藻紅素(Phycoerythrin)應(yīng)用效果較差,可能由于分子大的緣故。可同時應(yīng)用AAF和生物素標(biāo)記系統(tǒng)及汞與生物素系統(tǒng)分別應(yīng)用不同的熒光素去標(biāo)記兩條DNA進(jìn)行雙重染色。

  3.基本操作方法

 。1)玻片準(zhǔn)備:細(xì)胞用甲醇:醋酸(3:1)固定,滴在玻片上可保存在-20℃,如將此載片烘烤于65℃數(shù)小時,將會導(dǎo)致樣品的人工老化。應(yīng)用相差顯微鏡在低倍下定位最佳區(qū)域,或用嘴輕吹氣的方法可以看見浮動的細(xì)胞。在玻片背面圈出蓋片應(yīng)覆蓋的區(qū)域。

 。2)RNA酶處理:加50μlRNA酶溶液,蓋以蓋玻片,放在濕盒內(nèi)(2×SSC)37℃1h。應(yīng)用2×SSC漂洗2×3min,室溫,梯度酒精脫水(70%,90%,100%),在空氣中干燥。

  (3)蛋白酶K和多聚甲醛處理:對單個拷貝雜交,蛋白酶K溶液(0.3~0.6μg/ml,在20mmol/l Tris –HCl, pH7.5, 2mmol/L CaCl2)在37℃孵育2h。此法對甲醇-醋酸固定的淋巴細(xì)胞效果特佳,但這種濃度的蛋白酶K溶液對未事先經(jīng)多聚甲醛固定的染色體制片可在靶DNA變性步驟中完全破壞。因此,需根據(jù)細(xì)胞類型調(diào)整溶液的濃度和孵育時間。蛋白酶K消化后,以2×SSC,在室溫漂洗2min×3,再固定于4%多聚甲醛溶液中,室溫10min。2×SSC洗2min×3。

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