。4)靶DNA變性:將載片浸入70℃變性溶液(70%甲酰胺,2×SSC)2min。新鮮的變性溶液需每周配制,貯存于4℃冰箱中備用。一張?zhí)幱谑覝氐妮d片放入50ml的染色缸(coplin jar)內(nèi),將會使溶液溫度減低約1℃,因此,每次應(yīng)加入少量玻片,以免影響溶液的溫度致變性不完全。冷卻變性處理后的載片可放在冰上或浸入70%酒精溶液1min。漂洗加震動以終止反應(yīng)和徹底去除變性溶液。然后經(jīng)梯度酒精脫水(80%,90%,100%),空氣干燥。
。5)雜交液的準(zhǔn)備
MM1 甲酰胺5.0ml
硫酸葡聚糖1.0g
20×SSC 1.0ml
(或50%硫酸葡聚糖)2.0ml
MM2 甲酰胺 5.5ml
硫酸葡聚糖1 .0gm
20×SSC 0.5ml
首先將溶液在70℃加溫,以溶解硫酸葡聚糖,冷卻后調(diào)整pH至7.0,容量加至70ml。這容量是最后應(yīng)用的雜交混合液的70%,其余的30%為核酸探針和水(如果需要的話)。MM1給預(yù)雜交混合液是:50%甲酰胺,10%硫酸葡聚糖2×SSC。Trask發(fā)現(xiàn)MM2效果較MM1好,DNA的Tm比MM1低-8℃。在2×2cm區(qū)域雜交混合液應(yīng)為:MM17μl,DNA探針(保存液為500μg~10mg/ml)1μl,加探針混合液2μl,總量為10μl。
(6)雜交:每張蓋玻片加10μl雜交混合液,注意移除氣泡,可在蓋片四周加橡皮泥封固,在37℃濕盒中過夜。
。7)漂洗:從溫箱中取出后,以鑷子移除橡皮泥,從現(xiàn)在起注意勿使載片干燥。否則鹽的晶體將產(chǎn)生非特異性背景染色,漂洗應(yīng)用2×SSC(pH7)在45℃3min×3。不時震動以助徹底漂洗,蓋玻片將在漂洗中自然移除。然后再在2×SSC,45℃,2min×3。保存載片于PBS溶液內(nèi)。
。8)熒光顯示:
①生物素標(biāo)記DNA探針的熒光顯示。
1)應(yīng)用PBS含5%無脂干奶(5μl每張蓋片),也可用1%牛血清白蛋白(BSA)-PBS覆蓋孵育5min室溫,以封閉非特異性結(jié)合部位。
2)移除多余液體,加抗生素-FITC(5μg/ml在PBS含5%奶粉或1%BSA,5μl/cm2)。在濕盒中,室溫孵育20min?股锼-FITC在此應(yīng)用是過量的,因此,可回收貯存4℃再次應(yīng)用,其保存時間可達數(shù)周。反應(yīng)見圖20-4A直接法。
3)漂洗:PBs 2min×3,45℃。
4)如需放大(amplification),即提高其敏感度,可按圖20-4B間接法加生物素化羊抗抗生物素抗血清(biotinylated goat – antivaidin antibody)30min室溫。傾去加另一層抗生物素-FITC抗血清孵育20min,重復(fù)上述1)~3)。
、贏AF標(biāo)記核酸探針的熒光顯示
1)封閉非特異性結(jié)合部位:從PBS中取出載片,吸干多余液體,加PBS-0.1%吐溫(Tween)含2%正常羊血清(NGS)(5μl/每cm2蓋玻片)。使載片停留在室溫5min。2)傾去多余液體,加抗-AAF抗血清1:750,PBS-Tween –NGS溶液(如上i)5μl/cm2蓋玻片。室溫37℃。孵育30min.
3)漂洗:PBS-0.1%Tween室溫5min×3,間歇性振蕩。
4)羊抗小鼠IgG-FITC孵育,1:300~1:1000在PBS-0.1%Tween含2%NGS,37℃孵育30min,如3)應(yīng)用PBS-0.1%Tween 漂洗5min×3。
4.熒光標(biāo)記DNA探針在細胞核混懸液雜交中的應(yīng)用
。1)細胞核的分離:將培養(yǎng)的細胞制成細胞混懸液,或以胰蛋白酶消化法于培養(yǎng)蓋上收集培養(yǎng)細胞。應(yīng)用MgSO4染色分離方法分離細胞核(Van den Engh et al 1986, 在Traok和Van Den Engh 34章 )。細胞混懸液濃度為5×106/ml。利用RNA酶消化后,使核從細胞分離,細胞核混懸液濃度為4~5×106細胞核/ml。
。2)細胞固定和酸的處理:在5ml試管內(nèi)加冷的100%酒精不斷旋轉(zhuǎn)以達到滿意的固定。在冰上停留10min。在4℃離心(×150g)10min。重復(fù)加三次冷的100%酒精入試管內(nèi),離心,傾去。置于冰上10min,再離心。然后加入相當(dāng)核懸液1/2量的0.1n HCl , 0.5% Triton X-100。室溫停留10min。加入IBM-0.25%Triton X-100(IBM配方:50mmol/l KCl, 10mmol/L MgSO4, 5mmol/L HEPES pH8.0)。再離心,重復(fù)IBM漂洗(這時細胞核可在不染色情況下,以熒光顯微鏡觀察)后,以2×SSC-0.1%Tween漂洗1×3min,繼之加入等量2%的多聚甲醛在1×PBS-5mmol/l MgSO4。在室溫靜置站立10min。傾去上清液,加IBm -Triton X-100漂洗,離心,使細胞核混懸液最終濃度為108/ml,(可用IBM-Triton X-100稀釋約50倍,在血球計數(shù)器計數(shù)),混懸液鏡檢應(yīng)含單個,完整的細胞核。
。3)細胞核混懸液雜交
①配制雜交混合液:甲酰胺5份,20×SSC1份,50%硫酸葡聚糖2份,pH調(diào)至7.0。此原液(stock solution)可貯存在4℃冰箱內(nèi)。應(yīng)用時加1份10mg/ml鯡魚精子DNA(herring sperm DNA)。
、诨旌1μl的細胞核混懸液(108/ml)與18μl的雜交混合液,充分混勻。將此19μl混合液移入1.5ml容積的Eppendorf 管中(核含量約為105)。
③加入100ng/每管的AAF標(biāo)記DNA探針(如為生物素標(biāo)記DNA探針濃度為20~40ng/每管)。
④置70℃10min使DNA探針和核DNA變性。
、莺徒M織切片與DNA探針雜交方法相較,不同的是在加熱變性后切勿置冰上迅速冷卻以終止反應(yīng),而應(yīng)迅速轉(zhuǎn)入37℃孵育過夜。