（4)雜交后漂洗
�、僭诿抗苤屑尤�1.25ml 50%甲酰胺-2×SSC（pH7.0)，在42℃靜置10～15min。偶爾旋轉以助混勻。冷卻至室溫。加100μl經(jīng)dimethylsuberimidate(DEMS)處理的血細胞（107/ml)混勻，離心，室溫，10min，輕彈試管使沉淀的小塊散開，加入1.25ml 2×SSC(pH7.0)，42℃，繼之，靜置于室溫10～15min，如前離心，再加1.25ml IBM-Triton X-100,室溫靜置5min，離心。
注：DEMS處理紅細胞方法：經(jīng)漂洗并離心去除白細胞和血清的紅細胞在鹽液如PBS中，細胞含量為108/ml，以K2CO3和DEMS溶液處理3次，第1次：K2CO3為20mmol/L,DEMS為3mmol/L，以后2次：K2CO3依然為20mmol/L，而DEMS為10mmol/L。在應用前將K2CO3和DEMS液混合加入紅細胞混懸液中。在最后2次漂洗液中，應用100mmol/l K2CO3將pH調(diào)至9～10。在25℃，15min后，加入50μl，100mmol/l 的檸檬酸（citric acid)/每ml細胞混懸液的濃度以達固定紅細胞的目的。固定的紅細胞離心傾去上清液后，用2×SSC稀釋到108/ml，加0.1%疊氮鈉可在4℃保存至少1年。
�。�5)AFF標記的熒光顯示：加200μl的PBS含0.05%Tween和2%正常血清（NGS)，輕輕振蕩混勻，室溫靜置10min，加20μl 1：100的單克隆抗AFF抗體，37℃孵育45min，加1.25ml的PBS-Tween，室溫靜置10min，加20間歇性振蕩，離心，傾去上清液，加200μlPBS含0.05%Tween –2%NGS,振蕩，室溫靜置10min，加20μl的羊抗小鼠–FITC熒光標記抗血清，稀釋度1：100～1：300。孵育于37℃45min，加1.25ml PBS –Tween,室溫靜置10min，離心，傾去上清液。
�。�6)生物素標記探針的熒光顯示：加200μl 4×SSC含0.1%Trion X-100 和5%BSA。室溫靜置10min后，加20μl抗生物素標記FITC抗血清15μg/ml，孵育在37℃30min，以1.5ml 4×SSc –0.1% Trion X-100洗1次，加入1.25ml IBm –Triton X-100,室溫靜置10～15min，間歇振蕩、離心。
�。�7)熒光顯微鏡觀察：將細胞核混懸液稀釋于250μl的IBM-Trion X-100中，輕加振蕩混勻。為抗熒光褪色可加等量的抗褪色溶液至載片上的細胞核涂片上，選擇適當?shù)募ぐl(fā)波長觀察。
�。�8)流式細胞計：將750μl的細胞核混懸液通過流式細胞儀（Flow cytometry, FCM)，DEMS處理過的紅細胞作為對照（Df 530/30nm, Omega ·Optical Inc, Brattleboro, VT)。詳細操作見第十章 。
二、寡核苷酸探針的應用
寡核苷酸探針的優(yōu)點在于它能根據(jù)需要人工用DNA合成儀合成，其長度及分子大小比較一致，可以控制。其長度一般較克隆的DNA片段短。目前，寡核苷酸探針已能成功的為放射性同位素、熒光素、生物素和地高辛所標記，并成功地運用于培養(yǎng)細胞、組織切片和染色體鋪片等的原位雜交中。雖然有些科技工作者認為其敏感度不如來自質(zhì)粒擴增的cRNA或DNA探針，但由于探針制備簡便再加之于近年非放射性標記的成功，寡核苷酸探針在生物基礎醫(yī)學及臨床學科領域中得到較為廣泛的應用。
在原位雜交組織化學中應用寡核苷酸探針，其基本操作要點是相同的，如雜交溫度在Tm -25℃，雜交孵育時間以過夜（16h左右)為佳。應用寡核苷酸探針在原位雜交組織化學技術中的成功與否主要決定于探針的設計，使有效配對率增加而錯配（mismatch)減少。
�。ㄒ�)地高辛標記寡核苷酸探針的應用
1．組織處理
�。�1)冷凍切片：厚10～20μm，貼于事先經(jīng)清潔處理及涂有粘附劑的切片上。切片保存于-80℃，在應用于雜交實驗前，使迅速回升到室溫，干燥，固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4。PBS漂洗5min×3，孵育在2×SSc 10min。醫(yī).學 全在.線,提供www.med126.com
�。�2)石蠟包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蠟，以100%乙醇10min ×2，空氣干燥10min，從高到低梯度乙醇（95%，80%，70%)1min/每個濃度。PBs 5min×3，孵育在2×SSc 10min。
�。�3)離心細胞涂片：將細胞先以4%多聚甲醛固定，應用離心沉淀法，將沉淀物涂于有粘附劑的載片上，應用PBS（含5mmol/l MgCl2)5min×3漂洗。在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酐10min。在0.2mol/l Tris –HCl 含（0.1mol/L甘氨酸)pH7.410min。孵育在2×SSc 10min。
2．探針準備35pmol的寡核苷酸（oligo -)探針，3’ 終末標記以地高辛-11–dUTP。
3．預雜交和雜交加約300μl預雜交液（配制法見附錄)在每張載片上，室溫孵育1h。如為鯡魚精子DNA，在應用前須在沸水浴中加熱10min，而對酵母tRNA可不用加熱變性。
（1)應用預雜交液稀釋地高辛標記的Oligo-探針，探針理想工作濃度根據(jù)于待測核苷酸含量和實踐的結果。如對于檢測大鼠垂體的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC)mRNA的Oligo –探針，其理想工作濃度為342ng/ml(0.342ng/μl)。
�。�2)預雜交后以2×SSC漂洗，以吸水紙拭干切片周圍水份，加30μl雜交液在切片上，加硅化蓋玻片，在37℃過夜。如探針大于36堿基則雜交溫度為42℃。次日室溫2×SSC液漂洗切片1h，1×SSC漂洗切片1h（室溫)，0.5×SSc 37℃漂洗半小時，0.5×SSC室溫漂洗半小時。
4．地高辛顯示（同前)。
�。ǘ�)同位素標記寡核苷酸探針的應用
1．組織處理大鼠應用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛-磷酸緩沖液中，約2h后（也可置于4℃冰箱過夜)取腦浸于同樣固定液中加10%蔗糖溶液過夜，4℃。次日恒冷箱切片（-14℃)，厚14μm左右，貼于有粘附劑的載片上，37℃或室溫干燥以增加切片的粘附性。
2．雜交前處理同本章 第二節(jié) 放射性標記cRNA探針一節(jié) 。
3．雜交37℃過夜，余細胞同前。
4．雜交后漂洗2×SSc 5min×3，1×SSc 1min室溫，0.5×SSc 55℃15min×2，室溫漂洗于0.5×SSc 3min×2。梯度酒精脫水，切片室溫干燥。
5．浸核乳膠切片浸入核乳膠，黑盒封閉，在4℃曝光2～3周（視同位素種類)，顯影，復染，觀察。
�。ǖ诙�、三節(jié) 中所用試劑配制見附錄)。
