�。ǘ�)玻片和組織切片的處理
1．玻片的處理玻片包括蓋片和載片應(yīng)用熱肥皂刷洗，自來水清洗干凈后，置于清潔液中浸泡24h，清水洗凈烘干，95%酒精中浸泡24h后蒸餾水沖洗、烘干，烘箱溫度最好在150℃或以上過夜以去除任何RNA酶。蓋玻片在有條件時(shí)最好用硅化處理，錫箔紙包裹無塵存放（硅化方法見附錄)。
由于ISHH的實(shí)驗(yàn)周期長，實(shí)驗(yàn)程序繁雜，因此，要應(yīng)用粘附劑預(yù)先涂抹在玻片上，干燥后待切片時(shí)應(yīng)用，以保證在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中切片不致脫落。常用的粘附劑有鉻礬-明膠液，其優(yōu)點(diǎn)是價(jià)廉易得，但在長周期實(shí)驗(yàn)過程中，粘附效果不夠理想。多聚賴氨酸液具有較好的粘附效果，但價(jià)格昂貴，需進(jìn)口。近年Vector Lab (U.S.A.)推出一種新的粘附劑叫Vectorband Reagent,每一單位包裝可制備500～700張載玻片，粘附效果極佳，價(jià)格較多聚賴氨酸便宜，制片后可長期保存應(yīng)用。目前國內(nèi)尚無生產(chǎn)，需國外進(jìn)口（配方見附錄2)。
2．增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性此步驟根據(jù)應(yīng)用固定劑的種類、組織的種類、切片的厚度和核酸探針的長度而定。比如用戊二醛固定的組織由于其與蛋白質(zhì)產(chǎn)生廣泛的交叉連接就需要應(yīng)用較強(qiáng)的增強(qiáng)組織通透性的試劑。增強(qiáng)組織通透性常用的方法如應(yīng)用稀釋的酸洗滌、去垢劑（detergent)或稱清洗劑Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原蛋白酶和淀粉酶（diastase)等。這種廣泛的去蛋白作用無疑可增強(qiáng)組織的通透性和核酸探針的穿透性，提高雜交信號(hào)，但同時(shí)也會(huì)減低RNA的保存最和影響組織結(jié)構(gòu)的形態(tài)，因此，在用量及孵育時(shí)間上應(yīng)慎為掌握。
蛋白酶K（Proteinase K)的消化作用在ISHH中是應(yīng)用于蛋白消化的關(guān)鍵步驟，其濃度及孵育時(shí)間視組織種類、應(yīng)用固定劑種類、切片的厚薄而定。一般應(yīng)用酶k 1μg/ml(于0.1mol/l Tris/50mmol/L EDTA, pH8.0緩沖液中),37℃孵育15～20min，以達(dá)到充分的蛋白消化作用而不致影響組織的形態(tài)為目的。蛋白酶K還具有消化包圍著靶DNA的蛋白質(zhì)的作用，從而提高雜交信號(hào)。在蛋白酶K消化后，應(yīng)用0.1mol/L的甘氨酸溶液（在PBS中)清洗以終止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制劑。為保持組織結(jié)構(gòu)，通常用4%多聚甲醛再固定。Burns等（1987)報(bào)告應(yīng)用胃蛋白酶（Pepsin)20～100μg/ml（用0.1n HCl 配)37℃、30min進(jìn)行消化，所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于蛋白酶K。
不少實(shí)驗(yàn)工作者在多聚甲醛固定后，浸入乙酸酐（acetic anhydride)和三乙醇胺（tri－ethanolamine)中以減低靜電效應(yīng)，減少探針對(duì)組織的非特異性背景染色。有的作者除在室溫下浸于上述溶液10min外，還在預(yù)熱37℃的50%甲酰胺/2×SSC液中預(yù)雜交15min，然后用2×SSC，0.30mol/l NaAc/0.030mol/L枸櫞酸鈉液中浸15min。但Heinz、Hofer等一些著名學(xué)者卻對(duì)此持有異議，根據(jù)他們的實(shí)驗(yàn)和經(jīng)驗(yàn)證明，乙酸酐和三乙醇胺液的處理并不能起到減低背景的目的，不能改善ISHH的信/噪比例。
3．減低背景染色和免疫細(xì)胞化學(xué)染色一樣ISHH實(shí)驗(yàn)程序中，如何減低背景染色是一個(gè)重要的問題。ISHH中背景染色的形成是諸多因素構(gòu)成的。雜交后（Posthybridization )的酶處理和雜交后的洗滌均有助于減低背景染色。
預(yù)雜交（Prehybridization)是減低背景染色的一種有效手段。預(yù)雜交液和雜交液的區(qū)別在于前者不含探針和硫酸葡聚糖（Dextran sulphate)。將組織切片浸入預(yù)雜交液中可達(dá)到封閉非特異性雜交點(diǎn)的目的，從而減低背景染色。
有的實(shí)驗(yàn)室在雜交后洗滌中采用低濃度的RNA酶溶液（20μg/ml)洗滌一次，以減低殘留的和內(nèi)源性的RNA酶，減低背景染色。
4．防止RNA酶的污染由于在手指皮膚及實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，為防止其污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在整個(gè)雜交前處理過程都需戴消毒手套。所有實(shí)驗(yàn)用玻璃器皿及鑷子都應(yīng)于實(shí)驗(yàn)前一日置高溫（240℃)烘烤以達(dá)到消除RNA酶的目的。要破壞RNA酶，其最低溫度必須在150℃左右。有條件的國外實(shí)驗(yàn)室在消毒的玻璃器皿外包以錫箔紙以利于標(biāo)記和防止取出時(shí)空氣污染。在無高溫消毒的烤箱時(shí)，亦可用國內(nèi)出產(chǎn)的衛(wèi)生蒸汽消毒鍋（山東新華醫(yī)療器材廠生產(chǎn))。雜交前及雜交時(shí)所應(yīng)用的溶液均需經(jīng)高壓消毒處理。
�。ㄈ�)雜交（Hybridisation)
在ISHH，整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期是比較長的，實(shí)驗(yàn)程序也比較繁雜，而雜交在ISHH整個(gè)實(shí)驗(yàn)中可被認(rèn)為是“短兵相接”的一步。雜交前的一切準(zhǔn)備工作如增加組織通透性都是為了在雜交這一步驟中核酸探針能進(jìn)入細(xì)胞或組織與其內(nèi)的靶核苷酸相結(jié)合。因此，雜交是ISHH中關(guān)鍵的而且是最重要的一個(gè)環(huán)節(jié) 。
雜交是將雜交液滴于切片組織上，加蓋硅化的蓋玻片。國內(nèi)向正華等采用無菌的蠟?zāi)ご婀杌纳w玻片也可獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。加蓋片的目的是防止孵育過程中的高溫（50℃左右)導(dǎo)致雜交液的蒸發(fā)。因此，也有為穩(wěn)妥起見，在蓋玻片周圍加液體石蠟封固的，但作者認(rèn)為這并不十分必要，因封固的石蠟在高溫下融解反易導(dǎo)致雜交液的污染，必要時(shí)可加橡皮泥封固蓋片四周。硅化的蓋玻片的優(yōu)點(diǎn)是清潔無雜質(zhì)，光滑不會(huì)產(chǎn)生氣泡和影響組織切片與雜交液的接觸，蓋玻片自身有一定重量能與有限的雜交液吸附達(dá)到覆蓋和防止蒸發(fā)的作用。在孵育時(shí)間較長時(shí)，為保證雜交所需的濕潤環(huán)境，可將復(fù)有硅化蓋玻片進(jìn)行雜交的載片放在盛有少量5×SSC或2×SSC（standard saline citrate, SSC)溶液的硬塑料盒（要能防止高溫破壞)中進(jìn)行孵育。雜交液的成分和預(yù)雜交液基本相同，所不同的是加入了標(biāo)記的核酸探針和硫酸葡聚糖（配方見附錄)。
如前所述，雜交前的準(zhǔn)備只是為雜交的成功奠定基礎(chǔ)，要獲得滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在雜交這一實(shí)驗(yàn)過程中還須注意以下的環(huán)節(jié) 。
1．探針的濃度很難事先確定每一種實(shí)驗(yàn)探針的濃度，但要掌握一個(gè)原則，即探針濃度必須給予該實(shí)驗(yàn)最大的信/噪比值。背景染色的高低也與探針濃度有關(guān)。根據(jù)國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)工作者的經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為最佳原則應(yīng)是應(yīng)用最低探針濃度以達(dá)到與靶核苷酸的最大飽和結(jié)合度為目的。這和我們?cè)诿庖呒?xì)胞化學(xué)試驗(yàn)中選擇抗血清的最佳工作濃度的原則一樣。
探針濃度依其種類和實(shí)驗(yàn)需要略有不同，根據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)及所查閱文獻(xiàn)，在原位雜交細(xì)胞化學(xué)中，探針濃度為0.5～5.0μg/ml（即0.5～5.0ng/μl)。根據(jù)Heinz 、Hofelt實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn)，對(duì)放射性標(biāo)記的dsDNA或cRNA探針，其濃度在2～5ng/μl。Conlton認(rèn)為生物素標(biāo)記探針，其最佳濃度在0.5～5ng/μl。作者在英皇家研究生院Polak教授實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用于放射性標(biāo)記cRNA探針的濃度為0.5ng/μl，而在非放射性標(biāo)記（生物素或地高辛)cRNA探針濃度為2.5ng/μl，放射性標(biāo)記DNA探針濃度為1.0ng/μl。向正華等應(yīng)用地高辛標(biāo)記生長抑素cRNA探針獲得滿意結(jié)果，其探針濃度為0.5ng/μl。
必須強(qiáng)調(diào)的是，國內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室都證明加雜交液的量要適當(dāng)，以10～20μl/每張切片為宜。雜交液過多不僅造成浪費(fèi)，而且液量過多常易致蓋玻片滑動(dòng)脫落，影響雜交效果，過量的雜交液含核酸探針濃度過高，反易導(dǎo)致高背景染色等不良后果。
2．探針的長度一般應(yīng)用于ISHH探針的最佳長度應(yīng)在50～100個(gè)堿基之間。探針短易進(jìn)入細(xì)胞，雜交率高，雜交時(shí)間短。據(jù)報(bào)告，長500個(gè)堿基的探針，其雜交時(shí)間約需20h左右。200～500個(gè)堿基的探針仍可應(yīng)用，如超過500個(gè)堿基的探針則在雜交前最好用堿或水解酶進(jìn)行水解，使其變成短的片段，達(dá)到實(shí)驗(yàn)所需求的堿基數(shù)。
