原位雜交組織化學(xué)概述

　　（五)顯示（Visualization)

　　顯示又可稱為檢測系統(tǒng)（Detection system)。根據(jù)核酸探針標(biāo)記物的種類分別進(jìn)行放射自顯影或利用酶檢測系統(tǒng)進(jìn)行不同顯色處理（詳見本章　第二節(jié)　)。

　　細(xì)胞或組織的原位雜交切片在顯示后均可進(jìn)行半定量的測定，如放射自顯影可利用人工或計算機(jī)輔助的圖象分析檢測儀（computer – assisted image analysis)檢測銀粒的數(shù)量和分布的差異。非放射性核酸探針雜交的細(xì)胞或組織可利用酶檢測系統(tǒng)顯色，然后利用顯微分光光度計或圖像分析儀對不同類型和數(shù)量的核酸的顯色強(qiáng)度進(jìn)行檢測。但利用ISHH做半定量測定必須注意嚴(yán)格控制實驗的同一條件，切片的厚度和核酸的保存量如取材固定的間隔時間等。如為放射自顯影，核乳膠膜的厚度與稀釋度等必須保持一致。

　�。�六)對照實驗和ISHH結(jié)果的判斷

　　和其它實驗方法一樣，并非ISHH的任何陽性信號都是特異性的，故必須同時有對照試驗以證明其特異性。對照試驗的設(shè)置須根據(jù)核酸探針和靶核苷酸的種類和現(xiàn)有的可能條件去選定，常用的對照試驗有下列幾種（表20-1)。

表20-1 ISHH對照試驗一覽表

　　從理論上講，對照試驗設(shè)置愈多其靶核苷酸特異性確定愈可靠，但現(xiàn)實是不可能的。因此，在上述對照試驗中應(yīng)任選設(shè)至少3～4種用以證實ISHH結(jié)果的可靠性。在上述試驗中，標(biāo)明*者為比較可靠的對照試驗。①Northern 和Southern印跡雜交法證明的方式和用Western印跡法檢測抗體（蛋白質(zhì))的特異性一樣，是比較可靠的。②如果具備相當(dāng)?shù)拿庖呓M化抗血清，可用結(jié)合的免疫組織化學(xué)和ISHH法從蛋白質(zhì)（或多肽)水平和轉(zhuǎn)錄水平在相鄰切片或同一切片中證明同一種多肽和相應(yīng)mRNA共存于同一細(xì)胞中。③預(yù)先將切片用DNA酶或RNA酶消化，然后用ISHH技術(shù)證明丟失的是DNA或RNA。如同免疫組化的吸收試驗一樣，事先與特異性的cRNA或cDNA進(jìn)行雜交。再進(jìn)行ISHH，其結(jié)果應(yīng)為陰性。④由于同義RNA探針和組織內(nèi)mRNA序列順序是相同的，應(yīng)用其進(jìn)行ISHH，結(jié)果應(yīng)為陰性。檢測系統(tǒng)的對照如乳膠或酶顯色系統(tǒng)也應(yīng)在無標(biāo)記探針的情況下進(jìn)行。

　　ISHH的最大優(yōu)點是它的高度特異性，它可測定組織、培養(yǎng)的單個細(xì)胞或細(xì)胞提取物中的核苷酸含量。應(yīng)用高敏感度的放射性標(biāo)記cRNA探針在理想的ISHH的實驗條件下檢測mR－NA，其敏感度可達(dá)到20個mRNA拷貝/每個細(xì)胞。由于雙鏈DNA的穩(wěn)定性，在用ISHH定位DNA時很少發(fā)生丟失，降解。在靶核苷酸序列比較伸展的情況如染色體鋪片，長于2kb的探針可以應(yīng)用。因此，其敏感性高到能夠出在染色體鋪片上，有時甚至在組織切片上的單個基因拷貝。正因為如此，對ISHH結(jié)果的解釋應(yīng)持慎重態(tài)度，特別是前人未報告過的新發(fā)現(xiàn)。因為如前所述，影響ISHH實驗結(jié)果的因素太多，比如在外科或?qū)嶒炄〔暮笪醇皶r的固定或冷凍可由于組織中mRNA的降解而導(dǎo)致假陰性結(jié)果。另外，在各種類型核酸探針進(jìn)入細(xì)胞、組織和各種器官的能力，又叫可接近性（acessiblity)各異。這些諸多因素都將影響ISHH的實驗結(jié)果。

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