免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)-實(shí)驗(yàn)一 免疫血清的制備

第一部分 血清學(xué)技術(shù)

血清學(xué)技術(shù)指?jìng)鹘y(tǒng)的抗原抗體體外檢測(cè)方法，根據(jù)反應(yīng)現(xiàn)象和試驗(yàn)方法的不同可分為沉淀反應(yīng)、凝集反應(yīng)、溶解反應(yīng)和補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等類型，廣泛用于各類微生物抗原或其抗體、其它蛋白質(zhì)抗原或其抗體的檢測(cè)。雖然現(xiàn)有更為靈敏快速的方法和自動(dòng)化檢測(cè)儀器，但血清學(xué)技術(shù)仍然是免疫學(xué)檢驗(yàn)的基礎(chǔ)與核心。血清學(xué)技術(shù)的第一步是獲得高純度、強(qiáng)特異性的抗原或抗體。

實(shí)驗(yàn)一  免疫血清的制備

適量抗原經(jīng)合適的途徑注射動(dòng)物，能激發(fā)動(dòng)物產(chǎn)生免疫應(yīng)答，使其B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞，產(chǎn)生特異性抗體并釋放入血。當(dāng)血中抗體達(dá)到一定效價(jià)時(shí)采血，即可獲得特異性免疫血清(通常稱之為抗血清)。由于抗原分子具有多種抗原決定簇，可分別激活具有不同抗原識(shí)別受體的B細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，即多克隆抗體(polyclonalantibody)。目前人工制備的特異性抗體有多克隆抗體，單克隆抗體和基因工程抗體等�？贵w是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的材料，已知的診斷血清(抗體)常用于對(duì)抗原的分析鑒定和定量檢測(cè)。

針對(duì)某種抗原制備特異性抗血清是免疫學(xué)的基本技術(shù)之一。根據(jù)抗原的生物學(xué)和理化特性，可用不同的方法制得高純度的免疫原；再進(jìn)行不同形式的處理(例如加入佐劑)，可使其具有更強(qiáng)的免疫原性。

本試驗(yàn)以傷寒沙門菌H抗原和O抗原、綿羊紅細(xì)胞(SRBC)和人全血清為免疫原，以家兔為免疫動(dòng)物，制備兔抗傷寒沙門菌、兔抗SRBC和兔抗人血清的免疫血清。要求學(xué)生初步學(xué)會(huì)免疫原和佐劑的制作及免疫血清制備的基本方法，了解其意義和應(yīng)用，熟悉動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基本知識(shí)。

一、傷寒沙門菌抗血清的制備

【原理】

傷寒沙門菌H抗原為鞭毛抗原，屬鞭毛蛋白質(zhì)，不穩(wěn)定，可經(jīng)甲醛固定；O抗原為菌體抗原，屬細(xì)胞壁脂多糖，性質(zhì)穩(wěn)定、耐熱。將制備好的H、O抗原分別免疫健康家兔，家兔體內(nèi)可產(chǎn)生高效價(jià)的抗H抗體和抗O抗體，并主要存在于兔血清中。

   【材料】

1．菌株　傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(H₉₀₁)、傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(O_90l)。

2．培養(yǎng)基　普通瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂平板、普通瓊脂斜面培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基。

3．生理鹽水、0.4%甲醛生理鹽水、37℃水浴箱、恒溫培養(yǎng)箱。

4．無菌三角瓶、試管、刻度吸管、水平離心機(jī)、接種環(huán)、酒精燈。

5．Brown氏標(biāo)準(zhǔn)比濁管。

6．健康家兔(體重為2～2.5kg)。

7．無菌注射器(2ml)、5號(hào)針頭、2%碘酒、75%酒精、無菌棉簽等。

【方法】

1．制備傷寒沙門菌H抗原

⑴ 接種經(jīng)鑒定的傷寒沙門菌H_90l菌株至普通瓊脂平板內(nèi)，37℃培養(yǎng)16～24h，挑選典型光滑型菌落轉(zhuǎn)種至普通瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)18～24h。

⑵ 加5ml無菌肉湯至接種有細(xì)菌的普通瓊脂斜面上，靜置5～10min，搓動(dòng)試管，制成細(xì)菌懸液。

⑶ 將細(xì)菌懸液種于15cm瓊脂平板內(nèi)，盡量鋪平于培養(yǎng)基表面(可用涂布棒涂布)，37℃培養(yǎng)16～24h。

⑷ 用適量無菌0.4%甲醛生理鹽水沖洗刮取菌苔，移入無菌三角瓶內(nèi)，置37℃水浴24h，固定殺菌。

⑸ 取少許經(jīng)甲醛生理鹽水處理的菌液接種肉湯培養(yǎng)基作無菌試驗(yàn)。無菌生長者用無菌生理鹽水稀釋至5～10億菌／ml(用Brown氏標(biāo)準(zhǔn)比濁管測(cè)定)，即獲得傷寒沙門菌H抗原，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2．制備傷寒沙門菌O抗原

采用經(jīng)鑒定的傷寒沙門菌O_90l菌株，方法同上。收獲細(xì)菌時(shí)，取出大平皿，用適量生理鹽水沖洗刮下菌苔，移入無菌三角瓶，100℃水浴2h殺菌(或用0.5%石炭酸鹽水沖洗刮下菌苔，置37℃水浴過夜殺菌)。作無菌試驗(yàn)合格后，用生理鹽水稀釋成5～10億／ml，加入石炭酸至終濃度為5%即成O抗原菌液。4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3．動(dòng)物的選擇

選擇合適的動(dòng)物進(jìn)行免疫極為重要，除了要求動(dòng)物健康外，還應(yīng)考慮以下兩個(gè)因素：⑴抗原與免疫動(dòng)物的種屬差異越遠(yuǎn)越好；親緣關(guān)系太近不易產(chǎn)生免疫應(yīng)答(如兔－大鼠之間，雞－鴨之間)；⑵抗血清量的需要：大動(dòng)物如馬、騾等可獲得大量血清(一頭成年馬反復(fù)采血可獲得10000ml以上的抗血清)；但有時(shí)需要抗體的量不是很多，選用家兔或豚鼠即可。本實(shí)驗(yàn)選用家兔較合適。選好動(dòng)物后，檢測(cè)其體內(nèi)是否含有天然抗體(取兔耳緣靜脈血，分離血清，分別與傷寒沙門菌H和O抗原做試管凝集反應(yīng))，只選擇不含傷寒沙門菌H和O抗原天然抗體的家兔進(jìn)行免疫。最后，將家兔隨機(jī)分為2組，做好標(biāo)記。

4．免疫方法

免疫前，用生理鹽水將傷寒沙門菌H和O抗原洗滌3遍，然后稀釋至9億菌／ml。兔耳緣經(jīng)碘酒和酒精消毒后，從耳緣靜脈注射抗原(分H抗原和O抗原兩組)，按表1-1進(jìn)行。

表1-1　　制備傷寒診斷血清的免疫程序

5．檢測(cè)血清效價(jià)

末次注射后7～10d，抽兔耳靜脈血1ml，分離血清與相應(yīng)的抗原作試管凝集反應(yīng)，若血清效價(jià)大于1∶1280，即可收獲血清。若效價(jià)偏低，再用相應(yīng)抗原3ml加強(qiáng)免疫1～2次，可使抗體效價(jià)明顯升高。

6．收集血清

試血合格后，經(jīng)頸動(dòng)脈或心臟采血，置于干燥無菌的三角瓶內(nèi)，37℃30min，再置4℃冰箱，使血清析出，吸出血清成分以2000rpm離心20min，棄紅細(xì)胞；檢測(cè)凝集效價(jià)后，適量分裝，－20℃凍存?zhèn)溆�，也可加�?.01%的疊氮鈉(NaN3)防腐。

附：常用采血方法介紹

1．頸動(dòng)脈放血法 是最常用的方法，對(duì)家兔、山羊等動(dòng)物皆可采用。在動(dòng)物頸外側(cè)做皮膚切口，拉開皮膚后可見斜行的胸鎖乳突肌，將此肌鈍性分離并推向后方，即可見到淡紅色有彈性的總動(dòng)脈。將此動(dòng)脈輕輕游離(連同與之同行的迷走神經(jīng))，用絲線將遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端用止血鉗夾住，另一止血鉗夾住動(dòng)脈迷走神經(jīng)，用以固定。沿結(jié)扎處剪斷血管，用固定止血鉗將斷端放入瓶口，慢慢打開夾持的止血鉗，動(dòng)脈血立即噴射入瓶。如此放血的速度快，動(dòng)物死亡也快，取血量略少于其他放血法。如在放血大約總量的一半時(shí)，暫時(shí)將動(dòng)脈夾住片刻，再繼續(xù)放血，得血量可以多些。

2．心臟采血法 多用于豚鼠、大鼠、雞等小動(dòng)物。采血技術(shù)應(yīng)熟練，穿刺不準(zhǔn)容易導(dǎo)致動(dòng)物急性死亡。

3．靜脈多次采血法 家兔可用耳中央靜脈，山羊可用頸靜脈。這種放血法可隔日一次，有時(shí)可采集多量血液。如用耳靜脈切開法，一只家兔可采百余毫升血液(用頸動(dòng)脈放血最多可獲70～80ml，一般只有50ml左右)。用頸靜脈采集綿羊血，一次可放300ml，放血后立即回輸10%葡萄糖鹽水，三天后仍可采血200～300ml。動(dòng)物休息一周，再加強(qiáng)免疫一次，又可采血二次。如此，一只羊可獲1500～2000ml血液。小鼠取血往往采取斷尾或摘除眼球法，每鼠得血一般不超過2ml。

抗血清的分離多采用室溫自然凝固，然后放置37℃或4℃待凝塊收縮。前者迅速，但得血清較少；后者時(shí)間長，有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)溶血，但獲得血清多，而且效價(jià)不易下跌。

二、溶血素的制備方法

【原理】

綿羊紅細(xì)胞(SRBC)對(duì)家兔、小鼠等動(dòng)物屬于異種抗原。用SRBC懸液免疫家兔，家兔可針對(duì)SRBC的刺激產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，合成和分泌大量抗SRBC抗體，主要存在于被免疫兔的血清中。

在試管內(nèi)抗SRBC抗體與SRBC可發(fā)生結(jié)合，加入補(bǔ)體后，在一定條件下，經(jīng)一定時(shí)間會(huì)導(dǎo)致SRBC的溶解，故抗SRBC抗體又稱為溶血素。

【材料】

1．健康綿羊。

2．采血器材 無菌注射器(50或100ml)、16號(hào)針頭、剪刀、止血帶、酒精燈、無菌棉球、2.5%碘酒、75%酒精等。

3．無菌三角瓶(內(nèi)裝阿氏紅細(xì)胞保存液)、無菌離心管和吸管、橡皮乳頭、血球計(jì)數(shù)器等。

4．無菌生理鹽水、水平離心機(jī)。

5．健康家兔。

【方法】

1．制備綿羊紅細(xì)胞懸液

⑴ 用帶子交叉捆住綿羊四肢，使其側(cè)臥于地。剪去頸部部分毛，用止血帶扎住頸部，確定頸靜脈。

⑵ 用2.5%碘酒和75%酒精消毒綿羊皮膚及采血者手指，持注射器，與頸靜脈呈30度角，從頭部向軀干方向進(jìn)針，緩慢抽動(dòng)針芯，觀察是否進(jìn)入靜脈。一旦抽出血液，即固定注射器，抽取50～80ml血液，迅速注入含阿氏紅細(xì)胞保存液的三角瓶內(nèi)，立即混勻，4冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

⑶ 取適量脫纖維羊血于離心管內(nèi)，離心2000 rpm 5 min，吸棄上清及紅細(xì)胞沉積物表面的白膜，加適量無菌生理鹽水，毛細(xì)吸管吹吸幾次以混勻，再離心棄上清，重復(fù)3次。

⑷ 最后一次離心2000 rpm 10min，根據(jù)紅細(xì)胞壓積，用生理鹽水配成10%SRBC懸液。

⑸ 取少許10%紅細(xì)胞懸液再稀釋200倍，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，配成2.0×10⁸個(gè)細(xì)胞／ml。

2．免疫方法 免疫程序見表1-2。

表1—2 兔抗SRBC抗體制備免疫程序

3．收獲溶血素 免疫注射第20天試血，溶血效價(jià)達(dá)1∶2000以上時(shí)，收獲血清，用0.01%疊氮鈉防腐，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、兔抗人血清的制備

【原理】

以混合人血清免疫家兔，可獲得兔抗人血清抗體。為使混合人血清能誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生高效價(jià)特異性抗體，需添加佐劑。本試驗(yàn)采用弗氏完全佐劑，它可使抗原在體內(nèi)緩慢釋放，延長抗原在體內(nèi)的停留時(shí)間，以獲得較佳的免疫效果。

【材料】

1．健康家兔(體重2～2.5Kg)。

2．混合人血清。

3．弗氏完全佐劑。

4．無菌乳缽、滴管、注射器、9號(hào)針頭、2.5%碘酒、75%酒精、無菌棉簽等。

【方法】

1．混合人血清抗原的制備 

選健康志愿者(學(xué)生)或獻(xiàn)血員，靜脈采血5ml；放試管中置室溫下使其自然凝集，凝集后離心取上清約2.5ml。將多人(至少2～3人，最好10人以上)的血清混合，即為可用的人全血清。將人全血清用生理鹽水作1∶2～1∶5稀釋。

2．佐劑的制備

為了促進(jìn)抗體產(chǎn)生，可在注射抗原的同時(shí)，加入一種輔助劑，這種輔助劑稱為佐劑。佐劑一般是乳劑或懸液，當(dāng)與水溶液抗原混合后形成一種油包水或水包油的乳狀顆粒，這種顆粒延緩了抗原的釋放，增加了局部刺激作用�？乖�與佐劑同時(shí)應(yīng)用，可促進(jìn)抗原在淋巴組織中存留。佐劑本身可以有免疫原性，也可不具備免疫原性。常用的有免疫原性的佐劑有百日咳桿菌、革蘭陰性桿菌的內(nèi)毒素和抗酸桿菌(如結(jié)核分枝桿菌)等；非抗原性的佐劑有鋁乳、磷酸鈣、石蠟油、羊毛脂、表面活性劑、藻酸鈣、聚核苷酸、胞壁肽等。應(yīng)用最多的是福氏(Freund)佐劑，是用石蠟油、羊毛脂和卡介苗混合而成。

福氏佐劑分為不完全佐劑和完全佐劑，稱取羊毛脂12g，加液體石蠟20ml，高壓蒸汽滅菌后即成為弗氏不完全佐劑。在弗氏不完全佐劑內(nèi)加入一定量的死卡介苗，成為弗氏完全佐劑。佐劑和抗原的比例為1∶1。

3．在弗氏完全佐劑中逐滴加入等體積的混合人血清，置于無菌乳缽中，朝一個(gè)方向研磨，每加1滴，都要研磨均勻后再加第2滴，直到乳缽內(nèi)形成油包水的白色乳劑。將乳劑滴加于水中完全不散開時(shí)為合格。另一種方法是用兩個(gè)5ml注射器，在接針頭處用一尼龍管連通，一個(gè)注射器內(nèi)是佐劑，另一注射器內(nèi)為抗原。裝好后來回推注，經(jīng)多次混合逐漸變?yōu)槿閯�。本法�?yōu)點(diǎn)是無污染，節(jié)省抗原或佐劑，用此注射器可直接注射；缺點(diǎn)是不易乳化完全。乳化完全與否的鑒定方法是將一滴乳劑滴入水中，如立即散開，則未乳化好，如不散開漂在水面則為乳化完全。為了防止污染，有時(shí)在佐劑中加入抗生素。但抗生素有免疫抑制作用，如能注意無菌操作，就不必加入。

4．將乳劑抗原吸入不帶針頭的注射器內(nèi)，接上針頭后，盡量排除空氣，用無菌大試管套住注射器，于4℃保存。

5．按表1-3所示免疫程序進(jìn)行免疫注射。

表1-3 兔抗人血清制備的免疫程序

6．末次注射后7～10d試血。用免疫兔耳緣靜脈血血清為抗體，用生理鹽水作不同倍數(shù)稀釋；用12倍稀釋的混合人血清為抗原。按照沉淀反應(yīng)要求，作瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn)，以測(cè)定抗體效價(jià)。效價(jià)達(dá)1∶32以上，即可心臟采血，分離并收獲抗血清。

7．作好標(biāo)記，適量分裝，—20℃凍存。

【注意事項(xiàng)】

1．選擇動(dòng)物時(shí)，動(dòng)物種系與抗原來源的差異越遠(yuǎn)越好；動(dòng)物應(yīng)健康。處于青壯年時(shí)期。無特殊要求時(shí)最好為雄性。因有個(gè)體差異，故每種抗原最好免疫2～3只動(dòng)物。

2．本實(shí)驗(yàn)每個(gè)步驟都必須嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作，防止抗原的污染。

3．菌液濃度可用比濁法調(diào)正。

4．從耳緣靜脈抽血前，最好先用二甲苯涂擦耳緣背部，使充血便于進(jìn)針。助手必須捏住兔耳根直至抽血完畢。

5．制備壓積紅細(xì)胞時(shí)，應(yīng)無菌操作，避免劇烈振蕩；試管應(yīng)洗滌潔凈，充分干燥，以免發(fā)生溶血。

6．全血清做抗原時(shí)要用混合血清，以避免個(gè)體差異帶來的誤差。

7．紅細(xì)胞和細(xì)菌等顆粒性抗原比較容易誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，可直接用來免疫動(dòng)物；而血清等可溶性抗原則需要加入免疫佐劑，充分乳化，否則不易免疫成功。

8．免疫時(shí)采用皮內(nèi)多點(diǎn)注射易誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，提高血清的抗體效價(jià)。

9．免疫間隔時(shí)間無固定模式，但一般可溶性抗原首次免疫和第二次免疫以間隔10～20d為宜。

【思考題】

1．免疫血清制備的原理是什么?

2．試述免疫血清的應(yīng)用。

3．為什么制備H抗原的傷寒菌液要用0.4%甲醛生理鹽水處理?

4．制備SRBC懸液過程中，為何離心后要吸棄紅細(xì)胞沉積物表面的白膜?

5．為什么要采用多份人血清混合來制備人血清抗原?

6．佐劑的種類有哪些?主要成分是什么?如何制備?有何用途?

7．為什么不同抗原免疫動(dòng)物的途徑和程序不同?

8．檢測(cè)抗血清效價(jià)的方法有哪些?

實(shí)驗(yàn)二  沉淀反應(yīng)

可溶性抗原如血清，毒素、細(xì)菌浸出液等和相應(yīng)抗體相遇，當(dāng)二者比例適當(dāng)，并有電解質(zhì)參與時(shí)，形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)(precipitation)。參與沉淀反應(yīng)的抗原稱為沉淀原，抗體稱為沉淀素。由于沉淀原多為可溶性物質(zhì)，單位體積內(nèi)所含的抗原量較多，與抗體結(jié)合的總面積大，為求得抗原與抗體的適當(dāng)比例，操作時(shí)稀釋抗原而不是稀釋抗體，一般以出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象的抗原最高稀釋度作為沉淀反應(yīng)效價(jià)。

沉淀反應(yīng)是臨床上常用的血清學(xué)試驗(yàn)之一。它的種類很多，有環(huán)狀沉淀、瓊脂擴(kuò)散、免疫電泳等。利用可溶性抗原與相應(yīng)抗體在半固體瓊脂內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)散，當(dāng)抗原與抗體相對(duì)應(yīng)，二者比例適合時(shí)，就出現(xiàn)白色沉淀物。本試驗(yàn)可在試管內(nèi)、平皿中以及玻片上的瓊脂內(nèi)進(jìn)行操作。瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)可分為單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)與雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)等。

一、單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

【原理】

是單向免疫擴(kuò)散(single immunodiffusion)試驗(yàn)中的一種定量試驗(yàn)。將一定量的抗體混合于瓊脂內(nèi)，傾注于玻璃板上，凝固后，在瓊脂層中打孔，再將抗原加入孔中�？字锌乖�向四周擴(kuò)散，在抗原與抗體比例合適處，呈現(xiàn)白色沉淀環(huán)。沉淀環(huán)的直徑大小與抗原的濃度成正比。如事先用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，則未知標(biāo)本中的抗原含量可從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出。本試驗(yàn)主要用于檢測(cè)血清中IgG、IgM、IgA和補(bǔ)體C3等的含量。

【材料】

1．1.5%鹽水瓊脂(生理鹽水配制，瓊脂含量1.5%)。

2．人IgG診斷血清。

3．待檢標(biāo)本  人血清。

4．全國統(tǒng)一人血清免疫球蛋白參考血清，系凍干正常人混合血清。

5．載玻片、微量加液器、打孔器(直徑3mm)、注射針頭、兩腳規(guī)、直尺、半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙等。

   【方法】

1．將適宜稀釋度的診斷血清與預(yù)先溶化的1.5%瓊脂在56℃水浴中混勻，每塊載玻片澆注3ml，制成免疫瓊脂板。

2．用打孔器在免疫瓊脂板上打孔，孔間距為1.2～1.5cm，挑出孔內(nèi)瓊脂。

3．稀釋參考血清  每支干燥血清中加入蒸餾水0.5ml，待完全溶解后，用0.01M pH7.2～7.4PBS倍比稀釋成1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160等5種濃度。

4．加樣  用微量加液器取10μl各種不同濃度的參考血清，準(zhǔn)確地加到瓊脂板的各孔中，每種濃度加2個(gè)孔，用以制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)待檢血清時(shí)，血清用PBS作1∶40稀釋，每孔加10μl，每份標(biāo)本加2個(gè)孔。

5．加樣的瓊脂板置濕盒內(nèi)，經(jīng)37℃24h后取出，測(cè)各孔沉淀環(huán)直徑(圖1-1)。

   【結(jié)果】

1．取出瓊脂板，即可見清晰的乳白色沉淀環(huán)。

2．標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制   以各種濃度標(biāo)準(zhǔn)抗原的沉淀環(huán)直徑為橫坐標(biāo)，相應(yīng)孔中IgG含量為縱坐標(biāo)，在半對(duì)數(shù)紙上畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)待檢血清沉淀環(huán)的直徑，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，將查得的IgG含量乘以標(biāo)本的稀釋倍數(shù)，即為血清中IgG含量(圖1-2)。  

圖1-1  單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)示意圖

【注意事項(xiàng)】

1．制備免疫瓊脂板時(shí)要掌握好溫度。溫度過高會(huì)破壞抗體活性；溫度低于42℃則瓊脂很快凝固，不能制板。

2．應(yīng)從低濃度到高濃度的順序加樣，以免出現(xiàn)誤差。

3．沉淀環(huán)的直徑以毫米為單位測(cè)量。 

圖1-2 單向擴(kuò)散標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖

二、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)

   【原理】 

    是雙向免疫擴(kuò)散(double immunodiffusion)試驗(yàn)中的一種。將可溶性抗原和抗體分別加入瓊脂板上相對(duì)應(yīng)的孔中，兩者各自向四周擴(kuò)散，如果抗原和抗體相對(duì)應(yīng)，則在兩者比例適當(dāng)處形成白色沉淀線。此試驗(yàn)可檢測(cè)抗原或抗體的純度，滴定抗體的效價(jià)以及用已知抗原(抗體)檢測(cè)和分析未知抗體(抗原)。臨床上常用于檢測(cè)甲胎蛋白(AFP)，作為原發(fā)性肝癌的重要診斷指標(biāo)。雙向擴(kuò)散需時(shí)較長(24h)，靈敏度不是很高。

   【材料】

1．抗甲胎蛋白診斷血清。

2．臍帶血清。

3．待檢血清。

4．1%鹽水瓊脂，其他材料同單向擴(kuò)散。

【方法】

1．制板  載玻片置于水平位，將3ml已溶化的鹽水瓊脂倒在玻片上，鋪平，待冷。

2．打孔  用打孔器打孔，中央1孔，周圍6孔，孔距6mm，排列方式如圖1-3所示，將孔內(nèi)瓊脂挑出。

    3．加樣  用微量加液器往中央孔加入抗甲胎蛋白診斷血清；上下孔加臍帶血清作陽性對(duì)照；其余4孔加待檢血清，每孔量均為10μl，防止外溢。

    4．將瓊脂板放于濕盒內(nèi)置37℃溫箱中24h觀察結(jié)果。

【結(jié)果】

    1．若待檢血清標(biāo)本產(chǎn)生沉淀線，并與陽性對(duì)照所產(chǎn)生的沉淀線吻接成一線，則表示陽性。如無沉淀線或與陽性血清沉淀線交叉，則表示陰性(圖1-4)。

圖1-3  雙向擴(kuò)散法孔的大小及距離  圖1-4   雙向擴(kuò)散法結(jié)果示意圖

2．雙向擴(kuò)散時(shí)，在抗原和抗體的對(duì)應(yīng)孔和臨近孔之間，由于加入的抗原和抗體的成分不同，沉淀線的位置、數(shù)目與特征也有差別，這些都有助于分析抗原或抗體的成分。

⑴ 抗原與抗體的濃度相等，沉淀線在兩孔之間呈直線形；抗體的濃度比抗原低，沉淀線靠近抗體一方；抗原濃度比抗體低，沉淀線靠近抗原一方(圖1-5A)。

⑵ 在三角相對(duì)的排列孔中，若兩抗原孔抗原相同，與同一相應(yīng)抗體反應(yīng)，兩條沉淀線頂端相聯(lián)(圖1-5B)；若兩抗原孔抗原不相同，與兩種相應(yīng)抗體反應(yīng)，兩條沉淀線相交(圖1-5C)；若一抗原孔有兩種不同的抗原，另一抗原孔只有其中一種抗原，抗體孔有兩種相應(yīng)的抗體，則形成的沉淀線既能連接，又出現(xiàn)一小支帶(圖1-5D)。

   【注意事項(xiàng)】

1．孔中瓊脂取出后要盡快加樣，否則會(huì)有水分滲入孔中，影響加樣量。

2．加樣時(shí)動(dòng)作要輕，盡量防止血清起泡；所加各樣品不要溢出孔外，否則會(huì)影響沉淀線的形成。

3．?dāng)U散時(shí)間要適當(dāng)。時(shí)間過短，沉淀線不能出現(xiàn)；時(shí)間過長，會(huì)使已形成的沉淀線解離或散開而出現(xiàn)假象。

4．加抗原和抗體時(shí)，應(yīng)各用一只微量加液器，加樣前后要分別用生理鹽水清洗Tip頭。

三、對(duì)流免疫電泳

三、對(duì)流免疫電泳

【原理】

對(duì)流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis)是把雙向擴(kuò)散和電泳技術(shù)結(jié)合在一起的方法。多數(shù)蛋白質(zhì)抗原物質(zhì)在堿性環(huán)境中由于羧基電離而帶負(fù)電荷，在電泳時(shí)從負(fù)極向正極移動(dòng)�？贵w屬球蛋白，所暴露的極性基團(tuán)較少，在緩沖液中離解也少，而且分子量較大，移動(dòng)較慢，在瓊脂電滲作用下主要是順著電子流方向由正極向負(fù)極移動(dòng)，這樣就使抗原和抗體定向?qū)α�，發(fā)生反應(yīng)，并在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線，故可用于快速診斷。由于限制了雙向擴(kuò)散時(shí)抗原抗體的多向自由擴(kuò)散，因而也提高了試驗(yàn)的敏感性。

【材料】

1．1%瓊脂  用pH8.6巴比妥—鹽酸緩沖液配制，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2．電泳槽，其他試劑、檢材及其他材料同雙向擴(kuò)散。

【方法】

1．制板  如前法溶化1%瓊脂，澆注于載玻片，3ml／片，待冷。

2．打孔  要求孔距3mm，行距4～5mm，每張玻片可打數(shù)排孔。

3．加樣  一側(cè)孔加抗甲胎蛋白診斷血清，另一側(cè)孔加待檢標(biāo)本和陽性對(duì)照血清，至完全充滿孔內(nèi)為止。

4．電泳  將加好的樣品瓊脂板置電泳槽上，抗原孔側(cè)置陰極端，抗體孔側(cè)置陽極端。瓊脂板兩端分別用2層濾紙與緩沖液相連。接通電源，控制電流在4mA／cm板寬，電壓6～10V／cm板長，電泳約1h。

圖1-6   對(duì)流免疫電泳示意圖

   【結(jié)果】

將玻片對(duì)著強(qiáng)光源觀察，在待測(cè)抗原與抗體孔之間出現(xiàn)白色沉淀線，并與已知陽性對(duì)照比較(圖1-6)。

   【注意事項(xiàng)】

1．電泳時(shí)電流不宜過大，以免因發(fā)熱使蛋白質(zhì)變性或使凝膠斷裂。

2．抗原與抗體的電極方向不能接反。

3．抗原抗體相對(duì)濃度要適當(dāng)，抗原太濃太稀時(shí)都不易出現(xiàn)沉淀線。

4．電泳所需時(shí)間與孔間距離有關(guān)，距離越大，電泳時(shí)間越長。

四、免疫電泳

【原理】

免疫電泳試驗(yàn)(immunoelectrophoretictest)是將電泳和瓊脂擴(kuò)散相結(jié)合，用于分析抗原組成的一種定性方法，具有靈敏快速的優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)可分兩個(gè)步驟：

1．電泳  將待檢的可溶性物質(zhì)在瓊脂板上進(jìn)行電泳分離。由于各種可溶性蛋白分子的大小、質(zhì)量與所帶電荷不同，在電場(chǎng)的作用下，其帶電分子的運(yùn)動(dòng)速度也不相同，因此通過電流能夠把混合物中的各種不同成分分離開來。

2．瓊脂擴(kuò)散  電泳后在瓊脂槽中加入相應(yīng)抗血清，然后置濕盒內(nèi)讓其進(jìn)行擴(kuò)散。當(dāng)抗原與抗體相遇且比例適合時(shí)，可形成不溶性復(fù)合物，出現(xiàn)特異性沉淀線。根據(jù)沉淀線數(shù)量及位置可鑒定分析各種抗原成分及其性質(zhì)。

   【材料】

1．待檢標(biāo)本  正常人血清。

2．兔抗人血清。

3．1%離子瓊脂  用0.05M、pH8.6的巴比妥緩沖液配制。

4．載玻片、直徑3mm打孔器、0.2cm×0.6cm×6.0cm聚苯乙烯塑料條、微量加液器、電泳儀、注射器針頭、吸管等。

   【方法】

1．制板  載玻片放于水平臺(tái)面上，將塑料條按圖1-7放置于玻片上，吸取4ml熱溶的1%瓊脂于載玻片上，自然凝固后，取出塑料條，即成瓊脂槽，再按圖打孔，挑去孔中瓊脂。

2．加樣  用微量加液器往孔中加入標(biāo)本，勿使溢出。

3．電泳  電壓4V／cm，電泳1.5h。

4．?dāng)U散  瓊脂槽內(nèi)加入兔抗人血清，充滿槽內(nèi)，瓊脂板置濕盒內(nèi)37℃擴(kuò)散24h，觀察結(jié)果。

圖1-7   免疫電泳瓊脂板制作示意圖

圖1-8   免疫球蛋白的遷移范圍

【結(jié)果】

在槽的兩邊出現(xiàn)相對(duì)稱的弧形沉淀(圖1-8)。

【注意事項(xiàng)】

1．操作時(shí)動(dòng)作要輕巧，挖槽時(shí)要注意平行整齊，加入抗體時(shí)不要外溢。

2．電泳板擴(kuò)散后，可直接觀察，也可染色觀察。無色標(biāo)本要在黑色背景下，用斜射光觀察。

3．搭橋應(yīng)完全緊密接觸，以免因電流不均而發(fā)生沉淀線歪曲。

五、火箭免疫電泳

   【原理】

火箭免疫電泳(rocket immunoelectrophoresis)是在單向免疫擴(kuò)散的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種技術(shù)。檢測(cè)時(shí)將含有已知抗體的瓊脂澆成瓊脂板，打孔后加入待檢樣品和不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)抗原，經(jīng)電泳后，與相應(yīng)的抗體形成抗原抗體復(fù)合物，在兩者比例適當(dāng)?shù)牟课怀恋硐聛�，所形成的沉淀峰形似火箭，故名。沉淀峰的高低與抗原的濃度成正比，因此可以對(duì)抗原進(jìn)行定量測(cè)定。其敏感性較單向擴(kuò)散要高，而且快速。本試驗(yàn)介紹人血清IgG的定量檢測(cè)。

【材料】

1．抗原  待測(cè)人血清標(biāo)本及已知的純化人IgG樣品。

2．抗體  兔抗人IgG血清。

3．1%瓊脂  用0.05M pH8.6巴比妥緩沖液配制。

4．2.2mol/L甲醛液。

5．玻璃板(7×l0cm)、其他材料同免疫電泳。

【方法】

1．制板  先將1%瓊脂糖凝膠于沸水浴中加熱融化，保溫于52℃水浴中，加入適量兔抗人IgG，使抗體濃度為0.75%～1%，迅速混勻，傾注于水平放置的清潔干燥的玻璃板上，待其冷卻。

2．打孔  孔徑3mm，孔間距5mm。

3．抗原的醛化

⑴ 先將血清標(biāo)本和已知人IgG作不同濃度稀釋。前者稀釋為1∶40，后者稀釋為1∶10、1∶20、1∶40、1∶80。

⑵ 分別取0.3ml樣品和0.2ml 2.2mol/L甲醛液置于一列小試管內(nèi)，混勻，置37℃溫箱5min，進(jìn)行醛化。

4．加樣  于每孔內(nèi)加入不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)抗原及待檢抗原，每孔10μl。

5．電泳  抗原端接負(fù)極，電壓3V／cm，電泳6～8h。

   【結(jié)果】

1．瓊脂板上出現(xiàn)不同高度的沉淀峰，形似火箭樣（圖1-9)。

2．制作標(biāo)準(zhǔn)曲線  以沉淀峰的高度作縱坐標(biāo)，抗原濃度作橫坐標(biāo)，畫

圖1-9   火箭電泳示意圖

出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1-9)。以測(cè)得的待檢抗原峰的高度查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即知待檢

抗原濃度。

   【注意事項(xiàng)】

1．電泳后可直接觀察測(cè)量，也可干燥后染色觀察。

2．低電壓、低離子強(qiáng)度、較長電泳時(shí)間效果更好。

3．加樣后應(yīng)及時(shí)電泳。

【思考題】

 1．試比較沉淀反應(yīng)各種方法的原理和用途。

 2．對(duì)流免疫電泳時(shí)，抗原和抗體為什么會(huì)向相反方向運(yùn)動(dòng)？

 3．為什么不能用單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)來檢測(cè)血清IgE含量？

實(shí)驗(yàn)三  凝集反應(yīng)

顆粒性抗原在電解質(zhì)參與下，與相應(yīng)抗體結(jié)合形成肉眼可見的凝集團(tuán)塊，稱為凝集反應(yīng)(agglutination)。顆粒性抗原指細(xì)菌、螺旋體、紅細(xì)胞或帶有抗原的顆粒載體等。凝集反應(yīng)可分為直接凝集和間接凝集兩大類。

一、 直接凝集反應(yīng)

顆粒性抗原在電解質(zhì)參與下直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)的凝集反應(yīng)。在操作上有玻片凝集和試管凝集兩類。

（一)玻片凝集試驗(yàn)

【原理】用已知抗體(診斷血清)與待測(cè)抗原在玻片上的直接反應(yīng)，為定性實(shí)驗(yàn)方法，常用于細(xì)菌種的鑒定和分型，也用于ABO血型的鑒定。

細(xì)菌的鑒定

【材料】

1．傷寒沙門菌、痢疾桿菌斜面8～24h培養(yǎng)物。

2．1∶20生理鹽水稀釋的傷寒沙門菌診斷血清。

３．生理鹽水、接種環(huán)、載玻片等。

【方法】

1．將玻片分為3格，在第3格內(nèi)加1滴生理鹽水，第1、2格內(nèi)各加1滴傷寒沙門菌診斷血清。

2．用滅菌后的接種環(huán)從斜面挑取傷寒沙門菌菌苔少許，置于第3格內(nèi)磨勻，隨即將環(huán)上余菌置于第1格內(nèi)磨勻；接種環(huán)滅菌后挑取痢疾桿菌菌苔少許磨勻于第2格。

３．輕搖玻片，靜置1～2min后室溫下觀察結(jié)果。

【結(jié)果】

第1格內(nèi)形成白色小塊凝集物，第2、3格內(nèi)出現(xiàn)均勻渾濁現(xiàn)象。

【注意事項(xiàng)】

1．接種環(huán)每次取不同細(xì)菌培養(yǎng)物前后均要燒灼滅菌。

2．接種環(huán)須冷卻才能取細(xì)菌培養(yǎng)物，取時(shí)勿將瓊脂刮下。

3．載玻片應(yīng)置于消毒缸內(nèi)，切不可自行沖洗或亂丟；實(shí)驗(yàn)完畢后應(yīng)在消毒液中泡手2～3min。

ABO血型鑒定

紅細(xì)胞表面的A和(或)B抗原與相應(yīng)的抗體結(jié)合后使紅細(xì)胞凝集，借此判斷待測(cè)的ABO血型。

【材料】

1．抗A血清、抗B血清。

2．采血計(jì)、小試管(內(nèi)裝1ml生理鹽水)、玻片、牙簽、一次性針頭、酒精棉球等。

【方法】

1．紅細(xì)胞懸液的制備  皮膚消毒后針刺手指尖或耳垂，采1～2滴血入裝有1ml的生理鹽水的小試管中，混勻，即成約2%～5%的紅細(xì)胞懸液。

2．取潔凈玻片一塊，分為2格，分別標(biāo)記A、B字樣。將抗A血清、抗B血清各1滴加入A、B處。

3．取等體積的待測(cè)紅細(xì)胞懸液(也可用全血)分別滴加入A、B處，用牙簽的兩頭分別將紅細(xì)胞懸液(或全血)與血清調(diào)勻，同時(shí)不斷搖動(dòng)玻片并觀察紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。

【結(jié)果】

紅細(xì)胞凝集成塊，周圍液體澄清者為陽性(+)；紅細(xì)胞仍呈懸液，無凝集者為陰性（–)。根據(jù)凝集情況，判斷ABO血型(見表1-4))。

表1-4  ABO血型的鑒定

【注意事項(xiàng)】

1．待測(cè)血樣與抗血清調(diào)勻后，不要再用牙簽攪動(dòng)，以免影響大凝集塊形成。

2．試驗(yàn)在低于10℃可出現(xiàn)冷凝集，造成假陽性。

3．對(duì)含較多自身冷凝集素的受檢者，需用37℃生理鹽水洗滌受檢者的紅細(xì)胞2～3次，再鑒定血型，防止誤定為AB型。

（二)試管凝集試驗(yàn)

【原理】用已知診斷抗原與一系列稀釋后的待測(cè)血清在試管內(nèi)混合，觀察每管的凝集程度，以檢測(cè)抗體效價(jià)，為半定量試驗(yàn)方法。常用的有肥達(dá)試驗(yàn)和外斐試驗(yàn)，輸血時(shí)也用于交叉配血定性試驗(yàn)。

【材料】

1．1∶10稀釋的傷寒沙門菌“O”及“H”診斷血清、傷寒沙門菌“O”及“H”診斷菌液、生理鹽水。

2．小試管、試管架、刻度吸管等。

【方法】

1．列兩排試管，每排8支，依次編號(hào)，每管內(nèi)加入生理鹽水0.5ml。

2．用吸管吸取傷寒沙門菌“O”診斷血清0.5ml加于第一排的第1管，連續(xù)吹吸3次，充分混合后，吸取0.5ml加入第2管，同法混勻后又吸取0.5ml加入第3管，依此類推，連續(xù)稀釋到第7管，最后從第7管吸出0.5ml棄去，第8管為生理鹽水對(duì)照管。

3．同法稀釋第2排的傷寒沙門菌“Ｈ”診斷血清。

4．吸取傷寒沙門菌“O”菌液，于第一排各管內(nèi)加0.5ml(順序從第8管開始往第1管加)，同法于第二排各管內(nèi)加傷寒沙門菌“H”菌液0.5ml。

5．各管搖勻后，置室溫(或37℃)24h后觀察結(jié)果。操作步驟見表1-5。

     表1-5 試管凝集反應(yīng)操作步驟  單位：ml

管   號(hào)	1	2	3	4	5	6	7	8
生理鹽水	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	棄0.5   0.5
1/10傷寒血清	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
傷寒菌液	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
血清終稀釋度	1:40	1:80	1:160	1:320	1:640	1:1280	1:2560	—
室溫(或37℃)24h
結(jié) 果

【結(jié)果】

凝集程度

++++ 液體清澈，管底形成大片凝集物，表明細(xì)菌全部被凝集。

+++ 液體輕度渾濁，管底凝集物較少，表明細(xì)菌大部分被凝集。

++ 液體半澄清，管底有較多細(xì)小凝集物，表明細(xì)菌部分被凝集。

+ 液體渾濁，管底凝集物少，表明細(xì)菌少部分被凝集。

– 液體渾濁，管底有圓點(diǎn)狀細(xì)菌的沉積，邊緣整齊，表明細(xì)菌無凝集。

以產(chǎn)生明顯可見凝集現(xiàn)象(++)時(shí)血清的最高稀釋度作為血清中抗體的效價(jià)。

【注意事項(xiàng)】

1．混勻血清時(shí)不能產(chǎn)生氣泡，以免影響稀釋血清量的吸取。

2．觀察結(jié)果時(shí)應(yīng)先看第8管(對(duì)照管)，該管應(yīng)無凝集現(xiàn)象。

3．注意第1和第2排凝集現(xiàn)象的區(qū)別，“O”菌液凝集物為致密顆粒狀，不易搖起，“H” 菌液凝集物為疏松棉絮狀，輕搖易浮起。

4．前帶現(xiàn)象  抗原抗體反應(yīng)時(shí)必須有適當(dāng)?shù)谋壤�才能出現(xiàn)肉眼可見的凝集物，若抗原或抗體過多，均不形成肉眼可見的凝集物，此為前帶現(xiàn)象。在凝集反應(yīng)中通常稀釋血清抗體使其與抗原保持適當(dāng)比例。

【思考題】

1．直接凝集反應(yīng)有哪幾種？各有何用途？

2．什么是抗體的效價(jià)？為什么效價(jià)可以表示血清中抗體的含量？

3．凝集反應(yīng)的原理和沉淀反應(yīng)有何不同？

4．做完傷寒、痢疾桿菌鑒定后的玻片為什么不能直接用自來水沖洗？

二、間接凝集反應(yīng)

將可溶性抗原(或抗體)先吸附于適當(dāng)大小顆粒性載體的表面，然后與相應(yīng)抗體(或抗原)作用，使載體被動(dòng)凝集為肉眼可見的凝集物，稱間接凝集反應(yīng)或被動(dòng)凝集反應(yīng)。其檢測(cè)可溶性抗原的敏感性高于沉淀反應(yīng)。

(一) (正向)間接凝集反應(yīng)

【原理】

用可溶性抗原致敏載體以檢測(cè)相應(yīng)抗體。常用的載體有紅細(xì)胞、乳膠、活性炭等，因而根據(jù)載體的不同可分為間接血凝反應(yīng)、間接乳凝反應(yīng)、間接炭凝反應(yīng)等。臨床上常用于HBsAb、RF、梅毒反應(yīng)素等抗體的檢測(cè)。本試驗(yàn)以檢測(cè)梅毒反應(yīng)素為例。受梅毒螺旋體感染后，機(jī)體可產(chǎn)生一種非特異性的抗體—反應(yīng)素，該抗體能與牛肌心磷脂抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。將處理后的可溶性牛心肌磷脂抗原吸附到活性炭載體表面致敏以檢測(cè)反應(yīng)素，稱為RPR（rapid plasmareagin，快速血漿反應(yīng)素)試驗(yàn)，常用于梅毒的初篩。

【材料】

1．RPR試劑。

2．待測(cè)血清、凍干陽性對(duì)照血清(用時(shí)溶于0.2ml生理鹽水)。

3．RPR試驗(yàn)專用卡片。

4．9號(hào)無斜面針頭(滴加RPR試劑用)。

【方法】

1．取陽性對(duì)照血清、待測(cè)血清(不需滅活)各1滴約50μl，分別均勻涂滿整個(gè)卡片圈內(nèi)。

2．將RPR抗原試劑輕輕搖勻，擰開蓋，套上9號(hào)針頭，垂直向陽性和待測(cè)血清卡圈內(nèi)加1滴(約17μl)抗原。

3．用轉(zhuǎn)動(dòng)器或手搖卡片8min后在明亮光線下肉眼觀察結(jié)果。

4．如做半定量試驗(yàn)，可將待測(cè)血清做2倍系列稀釋，再按上述定性方法進(jìn)行試驗(yàn)。

【結(jié)果】

1．陽性反應(yīng)  可見中等或大的黑色凝集塊。

2．弱陽性反應(yīng)  可見散在的小黑色凝集塊。

3．陰性反應(yīng)  無顆粒凝集，或僅見有粗糙炭顆粒集中中央。

【注意事項(xiàng)】

1．RPR抗原試劑從4℃冰箱中取出后先要室溫下預(yù)溫；試驗(yàn)應(yīng)在23～29℃室溫中進(jìn)行，排除因室溫不符可能出現(xiàn)的假陽性。

2．搖完卡片后應(yīng)在3min內(nèi)觀察結(jié)果，因隨時(shí)間延長反應(yīng)性可逐漸增強(qiáng)。

3．使用專用針頭時(shí)應(yīng)采用垂直位置，使每滴大小均勻一致。

4．試劑卡片為一次性使用。

5．初篩陽性的結(jié)果，應(yīng)進(jìn)一步做梅毒確診試驗(yàn)。

(二) 反向間接凝集反應(yīng)

【原理】

用抗體致敏載體以檢測(cè)相應(yīng)可溶性抗原。根據(jù)載體的不同可分為反向間接血凝反應(yīng)、反向間接乳凝反應(yīng)等。臨床上常用于HBsAg、AFP等可溶性抗原檢測(cè)。將綿羊紅細(xì)胞或“O”型人紅細(xì)胞用醛類固定(稱為醛化，可使紅細(xì)胞易于吸附蛋白質(zhì)類抗原或抗體，可長期保存而不溶血)，再將純化的抗體吸附于醛化的紅細(xì)胞上而致敏，當(dāng)與可溶性抗原結(jié)合后，使紅細(xì)胞被動(dòng)凝集即血凝。本試驗(yàn)以AFP的檢測(cè)為例，將AFP抗體吸附于紅細(xì)胞來檢測(cè)AFP可溶性抗原，臨床上常作為原發(fā)性肝細(xì)胞癌的輔助診斷。

【材料】

1．已經(jīng)稀釋的AFP診斷血球(吸附抗AFP而致敏的紅細(xì)胞，凍干制劑每支加2ml生理鹽水溶解后充分搖勻即可)。

2．分別稀釋為1∶10、1∶100、1∶1000的陽性血清、陰性血清和待測(cè)血清。

3．微量血凝板、試管、吸管、生理鹽水。

【方法】

1．在微量血凝板上編號(hào)，用吸管吸取三payment-defi.com/hushi/種不同稀釋度的待測(cè)血清分別加入第一排的第1、2、3孔內(nèi)，每孔加1滴。同法取不同稀釋度的陽性血清、陰性血清分別加入第二、三排的1、2、3孔，第四排中的第1孔，加入生理鹽水1滴(25μl)（圖1-10)。

2．于上述各孔中分別加入稀釋的致敏血球1滴，充分搖勻后置37℃溫箱中，30min后觀察結(jié)果。

【結(jié)果】

陰性  血球沉于孔底呈致密圓點(diǎn)狀；

陽性  孔內(nèi)半數(shù)以上血球均勻平鋪孔底，呈中等以上面積的均勻薄膜；

   陰性血清及生理鹽水對(duì)照  血球全部下沉，集中在孔底成致密圓點(diǎn)狀；

陽性血清對(duì)照  血球均勻平鋪孔底成薄膜狀。

圖1-10 反向間接血凝檢測(cè)AFP

【注意事項(xiàng)】

1．所有用具(血凝板、試管、滴管)須高度潔凈；待測(cè)血樣及各種溶液須避免含AFP材料污染或雜菌污染。

2．診斷血球每次使用前必須充分搖勻。

3．每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)陽性、陰性和空白對(duì)照。

(三)間接凝集抑制反應(yīng)

【原理】

可溶性抗原致敏的顆粒與相應(yīng)抗體結(jié)合后可使顆粒凝集，但若此抗體先與待測(cè)的可溶性抗原結(jié)合，再加入抗原致敏的顆粒，則抗體不能再與致敏顆粒表面的可溶性抗原結(jié)合，此為間接凝集抑制反應(yīng)，用于可溶性抗原的檢測(cè)。臨床上常以乳膠為載體做妊娠診斷高級(jí)職稱考試網(wǎng)試驗(yàn)檢測(cè)絨毛膜促性腺激素(HCG)。

【材料】

1．HCG致敏的聚苯乙烯乳膠顆粒、兔抗人HCG免疫血清、待測(cè)尿、孕婦尿(HCG陽性)、正常尿。

2．載玻片、滴管、牙簽等。

【方法】

1．將玻片分為3格，于第1、2、3格內(nèi)分別加入1滴(50μl)待測(cè)尿、孕婦尿、正常尿。

2．于每格內(nèi)加入兔抗人HCG免疫血清各1滴，輕輕搖動(dòng)或用牙簽攪勻，使充分混勻，靜置1～2min。

3．于每格內(nèi)加入HCG致敏乳膠各1滴，輕輕搖動(dòng)或用牙簽攪勻，靜置3～5min后觀察結(jié)果。

【結(jié)果】

孕婦(HCG陽性)尿格內(nèi)呈均勻渾濁乳液狀；正常尿內(nèi)出現(xiàn)均勻白色細(xì)小顆粒狀凝集物；待測(cè)尿格若為乳液狀，則妊娠試驗(yàn)為陽性，若出現(xiàn)細(xì)小凝集物，則為陰性。

【注意事項(xiàng)】

1．待測(cè)尿以晨尿最好(HCG含量最高)，及時(shí)送檢或置冰箱冷藏，冷藏超過24h則置—20℃凍存，使用前先經(jīng)37℃水浴并充分混勻，標(biāo)本中若含紅細(xì)胞或較多蛋白和細(xì)菌污染則不宜使用。

2．應(yīng)在15℃以上進(jìn)行試驗(yàn)。如果溫度過低，可延長觀測(cè)時(shí)間1～2min。

3．滴加尿標(biāo)本應(yīng)與抗血清之液滴大小一致，二者搖勻后再滴加乳膠。滴加時(shí)切勿含有氣泡，否則影響結(jié)果。

(四)協(xié)同凝集試驗(yàn)

【原理】

葡萄球菌A蛋白(SPA)是金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁上的一種表面抗原，能與人或多種哺乳動(dòng)物的IgG Fc段非特異性結(jié)合而不影響Fab段與相應(yīng)抗原的特異性結(jié)合，使葡萄球菌被動(dòng)凝集，其本質(zhì)是一種間接凝集反應(yīng)，敏感性高，常用于病毒、細(xì)菌毒素等可溶性抗原檢測(cè)。

【材料】

1．金黃色葡萄球菌Cowan I株18～24h培養(yǎng)液、傷寒沙門菌O菌液、傷寒沙門菌O抗原的抗血清(56℃30min滅活)、pH7.2 0.2%甲醛緩沖鹽水、生理鹽水。

2．離心機(jī)、水浴箱、無菌滴管、吸管及試管、牙簽、玻片等。

【方法】

1．制備致敏菌液  用pH7.2 0.2%甲醛緩沖鹽水將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)液(經(jīng)80℃10min滅活)稀釋成10%的懸液，取此液1.0ml，加0.1ml傷寒沙門菌O抗原的抗血清，充分混勻后37℃水浴30min，3000rpm離心20min。棄去上清液，再用甲醛緩沖液將沉淀物洗滌一次，棄去上清，將沉淀物作適當(dāng)稀釋即成抗體致敏的金葡菌液。

2．將玻片分為三格，編號(hào)1、2、3，于第1、3格內(nèi)各加1滴傷寒沙門菌O菌液，第2格內(nèi)加1滴生理鹽水。

3．于第1、2格各加1滴抗體致敏的金葡菌液，第３格內(nèi)加未致敏的金葡菌液1滴。

4．用牙簽混勻，1～5min內(nèi)觀察結(jié)果。

【結(jié)果】

第1格內(nèi)形成白色凝集顆粒，第2、3格內(nèi)液體渾濁。

【注意事項(xiàng)】

1．協(xié)同凝集試驗(yàn)的特異性和反應(yīng)的強(qiáng)弱取決于致敏SPA菌液的免疫血清，因此要選擇特異性強(qiáng)和效價(jià)高的制劑。

2．SPA對(duì)不同種屬的IgG的親和力不同，在制備致敏SPA菌液時(shí)要選擇適當(dāng)動(dòng)物的抗血清。

3．每次試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)設(shè)陽性和陰性對(duì)照；同時(shí)還要設(shè)未致敏的金葡菌液對(duì)照，以排除菌體的自凝現(xiàn)象。

【思考題】

1．正向間接凝集試驗(yàn)和反向間接凝集試驗(yàn)的原理是什么？

2．間接凝集反應(yīng)有哪幾種？各有何用途？

實(shí)驗(yàn)四  單克隆抗體的制備

借助物理或化學(xué)手段，將二個(gè)或二個(gè)以上不同特性的細(xì)胞融合在一起，組成一個(gè)異型核(heterokaryous)細(xì)胞，新形成核細(xì)胞稱為雜交細(xì)胞。如果二個(gè)細(xì)胞中有一個(gè)為瘤細(xì)胞，則融合的細(xì)胞稱為雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞具有兩親本細(xì)胞的基因，并可表達(dá)親本細(xì)胞特性。由“免疫B細(xì)胞-漿細(xì)胞-瘤細(xì)胞”融合形成的雜交瘤細(xì)胞庫可產(chǎn)生單一、特異性、純化的抗體。該融合細(xì)胞是經(jīng)過反復(fù)克隆而挑選出來的，由該克隆細(xì)胞產(chǎn)生的抗體稱為單克隆抗體(monoclonal antibody，McAb)。一種McAb在分子結(jié)構(gòu)、氨基酸序列以及特異性等方面都是一致的，因此得到了廣泛的應(yīng)用。

【原理】

利用雜交瘤技術(shù)制備McAb的基本原理是：⑴淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體的克隆選擇學(xué)說，即一種淋巴細(xì)胞克隆只產(chǎn)生一種抗體；⑵細(xì)胞融合技術(shù)所產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞可以保持親代細(xì)胞雙方的特性；⑶利用代謝缺陷補(bǔ)救機(jī)理篩選出雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆化，然后大量培養(yǎng)增殖，制備所需的McAb。

應(yīng)用能夠長期生長的骨髓瘤細(xì)胞(純系小鼠腹水瘤型漿細(xì)胞，如X63、SP2／0等)和經(jīng)抗原致敏，且能分泌某種抗體的淋巴細(xì)胞(免疫動(dòng)物脾細(xì)胞)進(jìn)行融合。該種融合的雜種細(xì)胞一方面具有骨髓瘤細(xì)胞在體外連續(xù)傳代的能力，另一方面又繼承了免疫細(xì)胞能大量地合成、分泌特異性抗體的功能。這種融合的雜種細(xì)胞稱為淋巴細(xì)胞雜交瘤。

 【材料】

1．試劑 優(yōu)質(zhì)小牛(或胎牛)血清、DMEM培養(yǎng)液、HT適應(yīng)性培養(yǎng)基、HAT選擇性培養(yǎng)基、50%PEG。

2．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  6～8周齡雌性BALB／c小鼠。

3．細(xì)胞 小鼠骨髓瘤細(xì)胞一Sp2／0細(xì)胞。

4．抗原 病毒、細(xì)胞或可溶性抗原。

5．儀器 CO_２細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)(或無菌間)、倒置顯微鏡、24孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板、50ml塑料離心管等。

【方法】

1．雜交瘤細(xì)胞株的建立

⑴ 免疫BALB／c小鼠

病毒抗原  50ug抗原(蛋白)與等量佐劑乳化后，腹腔或皮下多點(diǎn)注射，間隔4～5周注射第二次，1周后注射第三次。最后以同樣劑量的抗原，經(jīng)尾靜脈加強(qiáng)免疫。3d后取脾。

可溶性抗原  100ug與2×10⁸滅活的百日咳桿菌混合，腹腔注射4～6周后，用100ug～200ug抗原再免疫一次，3d后取脾。

細(xì)胞抗原  2×10⁷細(xì)胞抗原鼠腹腔注射，2～3周后重復(fù)，共注射三次，3d喉后取脾。

⑵ 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備(融合前一天) 

在體外細(xì)胞培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易存活與繁殖，必須加入其他活細(xì)胞才易存活與繁殖，這種加入的其他細(xì)胞稱為飼養(yǎng)細(xì)胞。通常多用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)細(xì)胞。

    取正常BALB／c小鼠1～2只，拉頸處死，消毒后用小剪刀在小鼠腹部腹中線剪一橫口，將皮膚向兩邊撕開，暴露出腹部。然后將5ml DMEM液注入腹腔誘聚腹腔細(xì)胞，用原來的注射器將注入的液體吸回，放人50ml離心管中，離心1000rpm 10min，棄上清，加完全DMEM液(約5×10⁶／ml細(xì)胞數(shù))，按每孔0.1m1分裝到96孔培養(yǎng)板。置37℃含5%CO_２養(yǎng)箱過夜使用。

⑶ 骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備 

常用的骨髓瘤細(xì)胞系有2個(gè)，即NS一1和SP2／0。Sp2／0細(xì)胞本身不分泌任何免疫球蛋白或其組分，為應(yīng)用最多的骨髓瘤細(xì)胞系。

用含20%牛血清的DMEM擴(kuò)大培養(yǎng)Sp2／0細(xì)胞。融合的當(dāng)天在倒置顯微鏡下挑選大小均勻、透亮、輪廓清楚、規(guī)則的瘤細(xì)胞，輕輕吹下，收集于50ml離心管中，離心1000rpm 10min，用DMEM液懸浮細(xì)胞沉淀。臺(tái)盼藍(lán)染色檢

查活細(xì)胞數(shù)應(yīng)大于95%，置37℃?zhèn)溆谩?/p>

⑷ 免疫小鼠脾細(xì)胞懸液的制備(融合當(dāng)天) 

取加強(qiáng)免疫3d后的BALB／c小鼠1只，拉頸處死，消毒后無菌取出脾臟，放入平皿內(nèi)的200目鋼網(wǎng)上，加入10ml DMEM液，用注射器芯將脾細(xì)胞輕輕擠壓過網(wǎng)，即得脾細(xì)胞懸液，然后離心1000rpm 10min，棄上清，用DMEM液懸浮沉淀。細(xì)胞計(jì)數(shù)后冰浴備用。

⑸ 細(xì)胞融合 

選分子量為4000的PEG作融合劑，濃度為50%，過高濃度的PEG對(duì)細(xì)胞有毒性。在PEG的作用下，先引起細(xì)胞膜的融合，然后是核的融合。按細(xì)胞匹配法(2∶1～10∶1)，取1×10^８脾細(xì)胞與1×10^７骨髓瘤細(xì)胞混合于50ml離心管中，離心1000rpm 10min，傾去上清，輕彈管壁，使沉淀物混勻如糊狀；在37℃水浴中加入0.7ml 50%PEG促進(jìn)融合，邊加邊旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞保持均勻狀態(tài)，1min內(nèi)加完；靜置90s。立即在3～4min內(nèi)緩慢加入20ml DMEM液以終止反應(yīng)。室溫離心800～1000 rpm10min，棄上清，于融合細(xì)胞沉淀管內(nèi)加入含HAT的完全DMEM培養(yǎng)液20ml；按每孔0.1m1分裝入備有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)。置37℃，5%CO_２培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

⑹ 融合細(xì)胞培養(yǎng)及觀察 

融合后，每3～5d用HAT選擇培養(yǎng)液換液一次，連續(xù)2周；同時(shí)觀察并記

錄雜交瘤細(xì)胞是否出現(xiàn)。2周后，改用HT適應(yīng)性培養(yǎng)液。待雜交瘤克隆長至

1／4～1／5視野時(shí)，進(jìn)行陽性克隆的篩選。

圖1-11　　單克隆抗體制備的技術(shù)流程

2．雜交瘤細(xì)胞的篩選及鑒定

⑴ 陽性雜交瘤細(xì)胞株初選  雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的測(cè)定方法，可根據(jù)抗原的性質(zhì)和需要的靈敏度來選擇。如免疫熒光、酶標(biāo)記免疫實(shí)驗(yàn)、放免測(cè)定、

血凝試驗(yàn)、溶血空斑試驗(yàn)、抗體結(jié)合細(xì)胞制動(dòng)試驗(yàn)等。

⑵ 陽性雜交瘤細(xì)胞克隆化 克隆化就是指通過適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺�需單個(gè)細(xì)胞分離出來進(jìn)行培養(yǎng)。獲得單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)的這種方法，通常稱為克隆化。細(xì)胞通過克隆化可獲得單克隆細(xì)胞系，也可防止競(jìng)爭淘汰和防止外來干擾。

現(xiàn)在已建立起來的克隆化方法有多種：顯微挑選法、瓊脂空斑法、瓊脂分散法、有限稀釋法等。有限稀釋法的操作方法如下：其最大優(yōu)點(diǎn)是克隆率特別高，幾乎達(dá)100%。分三步進(jìn)行：①制備飼養(yǎng)細(xì)胞(方法同前)；②雜交瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)；③連續(xù)稀釋：將雜交瘤細(xì)胞稀釋到5～10個(gè)細(xì)胞／ml，再分別裝入備有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，每孔0.1ml(約1個(gè)雜種細(xì)胞)。培養(yǎng)和觀察同上。

⑶ 單克隆抗體Ig亞類鑒定  以分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為抗原，與羊抗鼠Ig及Ig亞類分別作瓊脂雙擴(kuò)散，觀察有無沉淀線出現(xiàn)。

3．單克隆抗體的大量制備及純化

雜交瘤細(xì)胞體外培養(yǎng)可得到的抗體效率有限，不能超過特定的細(xì)胞濃度，每天還要調(diào)換培養(yǎng)液，用體內(nèi)雜交瘤細(xì)胞繁殖可消除這些限制。

⑴ 單克隆抗體的制備  將0.5ml降植烷(或液體石蠟)注射每只BALB／c系小鼠(腹腔注射)，7～10d后腹腔注射10⁷分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。經(jīng)2～3周小鼠可產(chǎn)生實(shí)體瘤或腹水瘤，腹水增多。這時(shí)抽出腹水，置4℃離心3000 rpm 10min，取上清檢測(cè)抗體效價(jià)，分裝，低溫保存。

⑵ 單克隆抗體的純化 雖然單克隆細(xì)胞培養(yǎng)物或腹水中具有高滴度抗體，對(duì)某些研究工作亦足夠純，但其中仍有許多無關(guān)蛋白，它們來自培養(yǎng)基、宿主或克隆化細(xì)胞本身。因此有必要進(jìn)一步分離和純化。常用的方法有硫酸銨沉淀法和免疫親和層析法。

 【注意事項(xiàng)】

1．整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均應(yīng)嚴(yán)格無菌操作。

2．制備飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，注入和抽取腹腔液時(shí)，避開網(wǎng)膜，動(dòng)作要輕，以免損傷肝、脾。

3．PEG的量為0.7ml，加終止劑的速度要均勻。

4．McAb篩選前，應(yīng)提前選擇穩(wěn)定的方法，固定檢測(cè)系統(tǒng)及試劑。

5．換液時(shí)避免細(xì)胞克隆打散。

【思考題】 

1．McAb制備的原理是什么?McAb有何特點(diǎn)?

2．如何大量制備和純化McAb?