1983年Marshall和Warrer從慢性胃炎和消化性潰瘍患者胃粘膜中分離出幽門螺桿菌（Hp)后，經(jīng)研究表明Hp與慢性活動性胃炎關系密切，與消化性潰瘍的頑固不愈、早期復發(fā)有關。國外已有兩名志愿者口服Hp后引起活動性胃炎并出現(xiàn)消化不良癥狀。但對動物的感染較為因難，我國學者陳晶晶等于1991年報道了經(jīng)口感染8只Wistar大鼠成功，我們在此基礎上對Hp感染大鼠胃炎模型進行了進一步研究，并取得了較為滿意的結(jié)果。
1 材料和方法
1.1 菌株
Hp菌株為本院胃鏡室胃鏡檢查患者胃組織鉗取物直接接種于空腸變曲菌選擇性培基上，微需氧條件，37℃培養(yǎng)72h，檢查菌落，革蘭染色陰性桿菌，呈變曲或S型。尿素酶、氧化酶、過氧化氫酶試驗陽性并傳代培養(yǎng)，做為感染大鼠的Hp。
1.2 實驗動物
Wistar大鼠32只，雌雄各半，5月齡，體重175g～256g。購于白求恩國際和平醫(yī)院動物室。按體重編號，隨機抽取8只做為空白對照。
1.3 感染方法
參照陳晶晶報道方法進行。①將24只大鼠禁食12～14h，先用胃管喂以5％NaHCO32ml，5min后和胃管注入從培養(yǎng)基上沖洗下的Hp菌液1.5ml（108～1010cfu)，30min后給食。每周感染1次，共4次�？瞻讓φ战M不即予感染Hp，飼養(yǎng)條件同制模組。②于最后一次感染Hp后7d～10d，分將空白對照組8只大鼠和隨機抽取模型組8只大鼠，禁食12～14h，用乙醚麻醉處死。用無菌生理鹽水洗去胃內(nèi)容物，從靠近幽門的不同部位，剪取胃粘膜組織4～5塊，直接做尿素酶試驗，直接涂片，其余的胃組織用福爾馬林固定，常規(guī)制做病理切片，行HE和Warthin－Starry銀染色，供病理學檢查和Hp檢測。用于電鏡觀察的標本用2.5％戊二醛固定。③感染結(jié)束后4周，再隨機抽取8只模型鼠，按上述方法取胃粘膜組織，檢測項目同上。④感染結(jié)束后8周，將所剩8只模型鼠按上述方法取胃粘膜組織，檢測項目同上。
1.4 細菌學檢查
①尿素酶試驗：使用福建三強生物化工有限公司產(chǎn)SQ—H104半定量尿素酶試劑盒，按說明書操作及判定結(jié)果。②胃粘膜直接涂片檢菌法：將大量鼠組織粘膜面在玻片上直接涂抹，涂勻后加熱固定，革蘭染色，鏡檢Hp。
1.5 病理學檢查
將福爾馬林固定的大鼠胃組織，石蠟包埋，切成6μm厚的組織切片，分別用HE和Warthin－Starry銀染色，觀察病理變化和檢查組織切片中Hp。
1.6 電鏡觀察
將2.5％戊二醇固定的標本，用1％鋨酸后固定，常規(guī)Epon812樹酯包埋，半薄定位找到胃粘膜上皮細菌游離面，超薄切片厚50nm，常規(guī)鈾一鉛染色，JEM100csⅡ透射電鏡觀察。
1.7 Hp和炎細胞浸潤程度分級標準
�、賅arthin－Starry銀染色Hp檢測分為A～D4級。A級：未見Hp；B級：偶見Hp；C級：Hp呈散在分布或成簇分布；D級：大量Hp。②中性粒細胞浸潤分為0～3級。0級：未見中性粒細胞；1級：偶見中性料細胞；2級：中性粒細胞散在或成簇分布；3級：大量中性料細胞浸潤。③淋巴細胞浸潤分為0～3級。0級：未見淋巴細胞：1級：少量淋巴細胞；2級：淋巴細胞散在或成簇分布，3級：大量淋巴細胞。
2 結(jié)果
2.1 尿素酶試驗與細菌學檢查
�、倌Ｐ徒M于感染結(jié)束時和感染后4周，8只大鼠胃粘膜尿素酶試驗全部陽性（分別為5例＋，3例++與4例+，4例++)；直接涂片鏡檢革蘭染色均查到散在Hp。對照組均為陰性。②感染后8W8只大鼠7只尿素酶試驗陽性（4例＋，3例++)，同時均查到Hp，對照組均為陰性。③胃粘膜組織切片Warthin－Starry銀染色除感染結(jié)束后8W時除1例未找到Hp外，其他均找到Hp（表1)。主要分布于粘液層，粘膜上皮細胞表面和粘膜隱窩處。切片中呈變曲型，S型。對照組大鼠胃粘膜組織中未找到Hp。
表1 各Hp檢出率（n)
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感染分級 |
模型組感染Hp |
對照組 | ||
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結(jié)束時 |
結(jié)束后4周 |
結(jié)束后8周 | ||
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1 |
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1 |
8 |
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2 |
4 |
5 |
4 |
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3 |
4 |
3 |
3 |
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4 |
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2.2 病理學檢查
感染Hp大鼠的胃組織切片均有病變（表2)。對照組8只大鼠中僅3例可見少量淋巴細胞，1例可見少量中性粒細胞。炎細胞浸潤特點：炎癥分級中炎細胞浸潤至粘膜細胞基膜附近；2級炎性細胞浸潤至粘膜下層；3級炎細胞浸潤至胃壁全層。此與人類慢性胃炎的炎細胞只浸潤粘膜層有所不同。另外可見粘膜上皮細胞變性病灶，細胞腫脹而不規(guī)則，包漿內(nèi)結(jié)構(gòu)不清和消失，少數(shù)可見漿細胞和嗜酸細胞。
表2 各組炎性細胞浸潤程度（n)
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浸潤分級 |
模型組炎細胞浸潤 | |||||||
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結(jié)束時 |
結(jié)束后4周 |
結(jié)束后8周 |
對照組 | |||||
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L |
N |
L |
N |
L |
N |
L |
N | |
|
0 |
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1 |
5 |
7 |
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1 |
3 |
2 |
3 |
3 |
4 |
2 |
3 |
1 |
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2 |
4 |
4 |
4 |
2 |
3 |
3 |
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3 |
1 |
2 |
1 |
2 |
1 |
2 |
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2.3 電鏡觀察
經(jīng)電鏡觀察有明顯病變：上皮細胞游離面質(zhì)膜粘裂或消失，胞質(zhì)粘液顆粒減少或變性，粘液顆粒內(nèi)容物變性，使顆粒有芯，猶如胃癌時出現(xiàn)的“蛙卵樣”粘液顆粒，或變成低電子密度空泡。胞質(zhì)內(nèi)細胞器減少，呈空泡變性。細胞核畸形，嚴重者變性，染色質(zhì)邊集。粘膜內(nèi)嗜酸細胞增多。一份標本粘液內(nèi)有一菌體斜面，考慮為Hp�？瞻讓φ战M無病變，胃粘膜上皮細胞質(zhì)膜完整，腔面附有明顯粘液層，細胞游離端胞質(zhì)內(nèi)充滿粘液顆粒，細胞側(cè)面連接復合體明顯，胞質(zhì)細胞器豐富，常見線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。胞核較規(guī)則常染色質(zhì)較豐富。
3 討論
我們仿照陳晶晶的感染方法，對Hp感染W(wǎng)istar大鼠胃炎模型的制備進行了進一步的實驗研究，采取較大劑量活躍菌株，多次重復感染方法獲得成功。感染保持時間較長，感染后8周自然消失僅1例。研究結(jié)果表明：Hp對Wsitar大鼠尚屬易感。感染后所出現(xiàn)的病理變化與人類Hp相關胃炎類似，既有淋巴細胞浸潤又有中性料細胞浸潤。而Lambert感染悉生仔豬所制成的模型中性粒細胞只現(xiàn)于賁門部的非腺體區(qū)，不連貫且保持時間較短。本研究所制備的Wistar大鼠胃炎模型，其感染率、重復性及感染后出現(xiàn)的炎癥病變，均達到了做為Hp胃炎模型所需的指標。模型制做的成功，將對推動Hp致病機理、Hp相關性胃炎的防治等研究起到積極作用。
王丙信1 姚希賢2 白文元2
1解放軍第251醫(yī)院內(nèi)科（張家口075000)
2河北醫(yī)科大學附屬二院內(nèi)科（石家莊050017)
