 |
 |
表1 甲基化特異性PCR引物設(shè)計(jì)
引物名稱引物序列，5-3產(chǎn)物大小(bp)ST8iaII-M forGGTTTGGGTTTATAAATGGGATAGAGATGATC305ST8iaII-M revAACAAACGCCTAACGTCGCTCGST8iaII-U forGGTTTGGGTTTATAAATGGATAGAGATGATT 313ST8iaII-U revAACTACTTAACAAACACCTAACATCACTCAST8iaIV-M forGAAGTTGGCGGATTTGGAGTTTTGGAC225ST8iaIV-M revAAACCAACCAATCACCGTACTAAAAAAACGST8iaIV-U forGTTGAAGTTGGTGGATTTGGAGTTTTGAT 230ST8iaIV-U revCAAAACCAACCAATCACCATACTAAAAAAACA1.2.6 COBRA(combined bidulfite restriction analysis)：用來進(jìn)一步確定mST8SiaIV(PST)基因的甲基化。經(jīng)過亞硫酸鹽處理的DNA為模板，引物的設(shè)計(jì)不同于甲基化特異性的PCR，COBRA的PCR引物中不包含CpG二核苷酸，因此在擴(kuò)增的步驟中模板與模板之間不會(huì)再有區(qū)別。mST8SiaIV(PST)基因的擴(kuò)增體系為：mST8SiaIV(PST)35個(gè)循環(huán)，94℃30s，62℃30s，72℃30s，最后72℃延長(zhǎng)10min。3%瓊脂糖凝膠溶于1×TAE(TAE=1M Tis.HCL, 1.14ml Ammonium Acetate, 0.01M EDTA,pH8.0)電泳液，100V，30min。再用剩余的PCR產(chǎn)物17μl，NE buffer 2μl，BstU1限制性核酸內(nèi)切酶1μl，總反應(yīng)體系是20μl，反應(yīng)時(shí)間1h，反應(yīng)溫度37℃。然后再用3%瓊脂糖凝膠溶于1×TAE(TAE=1M Tis.HCL, 1.14ml Ammonium Acetate, 0.01M EDTA,pH8.0)電泳液，SYBR Gold染色，100V，30min。
1.2.6 斑點(diǎn)印記:用促進(jìn)DNA甲基化的甲硫氨酸或者使用DNA甲基化抑制劑依賴于轉(zhuǎn)錄抑制的丙戊酸處理Neuron2A細(xì)胞，處理后48h，收集細(xì)胞, 用稀釋的細(xì)胞裂解液將不同濃度的蛋白樣本點(diǎn)倒在斑點(diǎn)印記裝置上(BIORAD)的硝化纖維膜(ATTO)上，隨后用溶于1×PBS 1%的脫脂奶粉封閉硝化纖維膜1h，再加入抗-聚唾液酸-神經(jīng)細(xì)胞黏附分子抗體，4℃過夜。硝化纖維素膜用生物素連接的抗-鼠IgM抗體，然后用抗生素蛋白過氧化物酶混合試劑(Nacalai Tesque)法進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)色反應(yīng)采用ECL試劑，而且用化學(xué)發(fā)光器定量發(fā)光(BioRad)。
2 結(jié)果
2.1 甲基化特異性的PCR結(jié)果：胚胎鼠和小鼠的大腦、小腦、基底節(jié)和海馬顯示STX基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)沒有甲基化，PST基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)在18d的胎兒鼠的所有4個(gè)區(qū)域和成年鼠的2個(gè)區(qū)域-大腦和小腦都有甲基化，所分析的4個(gè)胎兒鼠和4個(gè)成年鼠標(biāo)本都顯示了相似的結(jié)果。
2.2 原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞：PST基因轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的甲基化是否具有細(xì)胞特異性， STX基因未發(fā)生甲基化，但是在PST基因在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)現(xiàn)的輕微的甲基化。在小鼠神經(jīng)纖維母細(xì)胞瘤細(xì)胞株-Neuron2A細(xì)胞的PST基因啟動(dòng)子分析中發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子幾乎完全被甲基化(圖1、2，見封二)醫(yī).學(xué)全.在.線網(wǎng)站payment-defi.com。
2.3 利用Neuro2a細(xì)胞PST基因甲基化的啟動(dòng)子作為一種神經(jīng)學(xué)方面的模型進(jìn)行了進(jìn)一步分析:用增加DNA甲基化的甲硫氨酸[6]，或者使用DNA甲基化抑制劑依賴于轉(zhuǎn)錄抑制的丙戊酸處理的Neuro2a細(xì)胞[7]，處理后48h，用斑點(diǎn)印記法分析了聚唾液酸的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)甲硫氨酸輕微的降低聚唾液酸的表達(dá)，但是丙戊酸明顯地增加了聚唾液酸的表達(dá)。結(jié)果顯示，用10mM甲硫氨酸處理過的細(xì)胞，在總蛋白為0.63μg/ml時(shí)，多聚唾液酸的表達(dá)降低到大約60%。另一方面，在用10mM丙戊酸處理的細(xì)胞，總蛋白為0.63μg/ml時(shí)，多聚唾液酸的表達(dá)增加到超過200%。
2.4 COBRA:用來進(jìn)一步確定mST8SiaIV(PST)基因的甲基化(圖3，見封二)。
3 討論
