醫(yī)學論文范文:假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體高效介導(dǎo)兔平滑肌細胞基因轉(zhuǎn)染

2.2 滴度檢測結(jié)果

每毫升含重組病毒MuLV顆粒上清液的滴度為5～6.2×105集落形成單位(CFU)，每毫升含重組病毒MuLV/VSV�睪顆粒上清液的滴度為6～7.8×106CFU。皰疹性口炎病毒G糖蛋白修飾的MuLV/VSV�睪轉(zhuǎn)染293T/17細胞，比單用MuLV所生產(chǎn)病毒的滴度有明顯提高(P<0.05)醫(yī).學全.在.線網(wǎng)站payment-defi.com。

2.3 假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)SMC鑒定

轉(zhuǎn)導(dǎo)后SMC行X�瞘al染色。方法：吸去細胞上清，5g/L Glutaradehyd固定細胞后，PBS清洗3遍后染色。X�瞘al染液：1g/L X�睪al (Gibco BRL)，2mmol/L MgCl2，5mmol/L K3Fe(CN)6和5mmol/L K4Fe(CN)6的PBS液，37℃過夜后倒置顯微鏡下計數(shù)10個隨機高倍視野下(200×)藍染細胞與總細胞的比率(圖2)。

2.4 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的比較

分別將假型逆轉(zhuǎn)錄病毒MuLV/VSV�睪及鼠白血病病毒MuLV轉(zhuǎn)導(dǎo)兔平滑肌細胞，發(fā)現(xiàn)MuLV/VSV�睪的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率明顯高于MuLV。MuLV/VSV�睪的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為(92±12)%，MuLV轉(zhuǎn)導(dǎo)效率為(24±5)%，二者差異比較有顯著性(P<0.01)。

3 討論

平滑肌細胞是血管壁的主要細胞成分之一，血管平滑肌細胞增生是血管性疾病如動脈粥樣硬化和移植血管再狹窄的重要原因。將相關(guān)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到平滑肌細胞中抑制平滑肌細胞增生可以達到治療血管性疾病的目的。

平滑肌細胞作為基因治療的靶細胞具有很多獨特的優(yōu)越性如易獲取和體外擴增，易受外源基因的轉(zhuǎn)染并能穩(wěn)定地表達外源基因，致瘤性低和相對其他細胞安全等[8]。

載體的選擇直接決定了基因表達的有效性、表達持續(xù)時間以及轉(zhuǎn)染的安全性。腺病毒載體作為一種常用的載體轉(zhuǎn)染效率較高，但由于被轉(zhuǎn)染的基因沒有融合到染色體，基因的表達是短暫的。而MuLV衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可以穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染基因并長期表達。但逆轉(zhuǎn)錄病毒載體因轉(zhuǎn)染效率較低[7]，需要通過篩選來殺死未被轉(zhuǎn)染的細胞。為了篩選，需要在基因結(jié)構(gòu)中加入抗性基因和相關(guān)的啟動子。例如，新霉素類G418，來殺死未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞。只有轉(zhuǎn)染了目的基因和抗性基因的細胞才能存活下來。如果載體轉(zhuǎn)染基因的效率接近100%，篩選的過程就可以省略。省略篩選既可以簡化基因的結(jié)構(gòu)又可以減少篩選的時間和存活細胞復(fù)制的時間。提高基因轉(zhuǎn)染效率是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體用于基因轉(zhuǎn)染的關(guān)鍵。VSV�睪/MuLV將報告基因lacZ轉(zhuǎn)染到平滑肌細胞的效率達到90%，幾乎所有的細胞都被轉(zhuǎn)染，所以可以認為篩選已經(jīng)不必要了。假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體VSV�睪/MuLV具有高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[4]，有以下幾種因素：①VSV�睪包膜糖蛋白是單鏈肽，比MuLV更穩(wěn)定，穩(wěn)定的包膜有利于高滴度病毒上清液的產(chǎn)生，提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。②可以更多地結(jié)合病毒的受體，以便VSV�睪/MuLV與細胞結(jié)合。

采用小鼠成纖維細胞NIH3T3細胞對重組逆轉(zhuǎn)錄病毒液進行滴度測定，是由于NIH3T3容易在體外培養(yǎng)，具有較長的壽命，容易被外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，是良好的基因轉(zhuǎn)移靶細胞。本研究成功的構(gòu)建了假型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體VSV�睪/MuLV，用于轉(zhuǎn)染平滑肌細胞獲得了較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，說明該載體可以用于平滑肌細胞的基因轉(zhuǎn)染并進一步應(yīng)用于基因治療之中醫(yī).學全.在.線網(wǎng)站payment-defi.com。

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