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1.2 T細(xì)胞的分離培養(yǎng) 取正常健康志愿者外周血5mL于肝素抗凝管中，加入RosetteSep人T細(xì)胞富集抗體混合液(50mL/L全血)，充分混勻,室溫靜置30min，以等倍體積PBS稀釋，充分混勻后小心加到淋巴分離液上，以20℃、2000r/min離心20min，取中間單核細(xì)胞層，用PBS液洗兩次(4℃、1500r/min 15min)，然后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×109～4×109/L。
1.3 潮霉素篩選濃度的確定 于6孔板中，接種T細(xì)胞3.0×105/孔，加含100mL/L FBS的DMEM培養(yǎng)基2mL，分別加入50g/L的潮霉素2、4、6、8、10、12μL，潮霉素終末質(zhì)量濃度依次為50、100、150、200、250、300mg/L，37℃培養(yǎng)。每3d換液1次。顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀況，以第8天能殺死孔內(nèi)所有T細(xì)胞的潮霉素濃度確定為篩選濃度醫(yī).學(xué).全.在.線payment-defi.com。
1.4 脂質(zhì)體介導(dǎo)的T細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24h，在6孔板內(nèi)按1×106細(xì)胞/孔接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染方法按試劑說明書進(jìn)行。3周后將穩(wěn)定生長的細(xì)胞克隆逐次轉(zhuǎn)移至24孔板、6孔板和培養(yǎng)瓶中擴大培養(yǎng)，獲得整合有pSilencer3.1H1重組質(zhì)粒并能穩(wěn)定表達(dá)siRNA1和siRNA2的單克隆細(xì)胞株。
1.5 細(xì)胞生長曲線的繪制 將已轉(zhuǎn)染了siRNA1和siRNA2的單克隆細(xì)胞株制備單細(xì)胞懸液，接種96孔板，設(shè)5個復(fù)孔，37℃、50mL/L CO2條件下培養(yǎng)。設(shè)正常人T細(xì)胞作為對照組。1、2、3、4、5、6、7d時，棄液，每孔加入20μL 5mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄液，每孔加入150μL DMSO，震蕩10min溶解結(jié)晶，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔490nm的吸光度值。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。
1.6 RTPCR檢測TGFβⅡR的表達(dá) 根據(jù)人TGFβⅡR的基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計了擴增TGFβⅡR的RTPCR引物P1和P2，以βactin作為內(nèi)參照。引物由上海Sangon公司合成。βactin：5′CTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3′，5′ C
TCCTTAATGTCACGCACGATTTC 3′，520bp，退火溫度52℃;TGFβⅡR：5′ TTTCCACCTGTGAC
AACC 3′，5′ TGACAGATATGGCAACTC 3′，346bp，退火溫度55℃。按照TRIZOL說明書提取細(xì)胞總RNA。按照RTPCR試劑盒說明書,將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,再將所得的cDNA進(jìn)行PCR擴增。取5μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，經(jīng)過15g/L瓊脂糖凝膠電泳后,在紫外投射反射儀下觀察結(jié)果。采用DNA MarkerⅠ作為DNA長度標(biāo)志。通過凝膠圖像成像分析系統(tǒng),以目的基因的PCR擴增片段灰度與相應(yīng)的內(nèi)參βactin擴增片段灰度的比值作為其mRNA表達(dá)水平的相對參數(shù)。
1.7 Western blot檢測TGFβⅡR的表達(dá) 選取一抗為兔抗人TGFβⅡR多抗，二抗為生物素化山羊抗兔IgG。嚴(yán)格按照ECL Western blot試劑盒說明書步驟操作。
1.8 人牙周膜細(xì)胞的分離培養(yǎng) 選取11～14歲青少年因正畸而拔除的前磨牙，用PBS液反復(fù)沖洗，無菌條件下刮取牙根中1/3的牙周膜組織，剪碎后用2.0×105u/L Ⅰ型膠原酶37℃消化1h，800r/min離心5min，棄上清;用無血清DMEM培養(yǎng)液懸浮組織，800r/min離心5min，棄上清;加適量含100mL/L新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，連同組織塊轉(zhuǎn)至6孔板，37℃，950mL/L空氣、50mL/L CO2、100%濕度條件下培養(yǎng)。每2～3d換液1次。取第5～8代細(xì)胞用于實驗。免疫組化法檢測波形絲蛋白和角蛋白抗體以鑒定細(xì)胞來源。
1.9 實驗分組 將轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染靶向性TGFβ ⅡR基因沉默的T細(xì)胞與人牙周膜細(xì)胞置于含有1.0g/L的LPS(美國Sigma公司，按說明書配制)和1.0mg/L黃芩苷溶液(中國藥品生物制品檢定所，精密稱取干燥至恒重的黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品5.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL容量瓶中，再將其濃度稀釋至1.0mg/L)的培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)48h。實驗分為6組：①正常牙周膜成纖維細(xì)胞+內(nèi)毒素+轉(zhuǎn)染siRNA1的T細(xì)胞+黃芩苷;②正常牙周膜成纖維細(xì)胞+內(nèi)毒素+轉(zhuǎn)染siRNA1的T細(xì)胞;③正常牙周膜成纖維細(xì)胞+內(nèi)毒素+正常T細(xì)胞+黃芩苷;④正常牙周膜成纖維細(xì)胞+內(nèi)毒素+正常T細(xì)胞;⑤正常牙周膜成纖維細(xì)胞+黃芩苷;⑥正常牙周膜成纖維細(xì)胞.
