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1.10 RTPCR檢測(cè) 用TRIZOL試劑盒提取牙周膜細(xì)胞總RNA，取2.5μg總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。OPG分子引物序列：上游引物5′TCAAGCAGGAGTGCAATCG3′，下游引物5′AGAATGCCTCCTCACACAGG3′，該引物將產(chǎn)生342bp的cDNA片段。RANKL分子引物序列：上游引物5′GGCTCATGGTTAGATCTGGC3′，下游引物5′TGACCAATACTTGGTGCTTCC3′，該引物將產(chǎn)生351bp的cDNA片段。βactin分子引物序列：上游引物5′CAATTCATGTTTGAGACCTTCAA3′，下游引物5′CCGGATCCATCTCTTCCTGGAAGTCCA3′，該引物將產(chǎn)生362bp的cDNA片段。上述引物序列由由上海Sangon公司合成。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物15μL在15g/L瓊脂糖凝膠上電泳，置于凝膠電泳成像儀，利用凝膠系統(tǒng)分析軟件Bandscan 5.0進(jìn)行半定量分析。
1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析，顯著性水準(zhǔn)a=0.05。
2 結(jié) 果
2.1 重組質(zhì)粒的鑒定 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后，從平皿上挑取3個(gè)單克隆菌落提取質(zhì)粒，酶切鑒定后10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒泳動(dòng)速度相同，初步表明質(zhì)粒重組成功。將鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列鑒定，結(jié)果與設(shè)計(jì)的目標(biāo)序列完全一致，表明已成功構(gòu)建了TGFβⅡR siRNA表達(dá)載體。
2.2 潮霉素篩選濃度的確定和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選 經(jīng)不同濃度的潮霉素篩選后，T細(xì)胞在含 100mL/L FBS、200mg/L G418和200mg/L潮霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)到第8天時(shí)全部死亡;其他條件保持不變，僅潮霉素為150mg/L時(shí)培養(yǎng)到第10天時(shí)細(xì)胞仍有部分存活。因此，選擇200mg/L潮霉素為轉(zhuǎn)染后T細(xì)胞的篩選濃度。
2.3 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)T細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 分別轉(zhuǎn)染siRNA1和siRNA2的T細(xì)胞生長(zhǎng)速度與對(duì)照組正常T細(xì)胞的生長(zhǎng)速度相似(圖1)，各組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)醫(yī).學(xué).全.在.線payment-defi.com。
圖1 T細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線
Fig.1 Growth curve of T cells
2.4 siRNA轉(zhuǎn)染的T細(xì)胞中TGFβⅡR的表達(dá) RTPCR(圖2A)和Western blot(圖2B)結(jié)果均顯示，轉(zhuǎn)染siRNA1的T細(xì)胞組的TGFβⅡR 產(chǎn)物的條帶明顯暗于對(duì)照條帶，轉(zhuǎn)染siRNA2的T細(xì)胞組的TGFβⅡR表達(dá)產(chǎn)物與對(duì)照組細(xì)胞相比無明顯變化。提示轉(zhuǎn)染siRNA1的T細(xì)胞組的TGFβⅡR mRNA的表達(dá)被明顯抑制。表明siRNA1對(duì)T細(xì)胞中TGFβⅡR mRNA的降解作用是高效的、特異的。
2.5 各組OPG和RANKL在牙周膜細(xì)胞上的表達(dá) 經(jīng)RTPCR檢測(cè)，各組OPG和RANKL在牙周膜細(xì)胞上的表達(dá)各不相同(圖3)。
2.6 各組RANKL/OPG比值的比較 以組別為x軸，以RANKL與OPG的比值為y軸，建立圖4。結(jié)果顯示，RANKL/OPG比值在各實(shí)驗(yàn)組中由大到小依次為：實(shí)驗(yàn)組④>②>①>③>⑥>⑤，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。
3 討 論
本實(shí)驗(yàn)采用Ambion公司開發(fā)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pSilencer RNA系統(tǒng)，將編碼針對(duì)TGFβⅡR siRNA的DNA模板定向克隆，使插入序列能被有效轉(zhuǎn)錄，從而形成內(nèi)源性表達(dá)的RNA。RNA正向鏈的3端Psilencer載體穩(wěn)定表達(dá)的siRNA可持續(xù)、高效、特異性地抑制目的基因的表達(dá)。
TGFβ受體目前共發(fā)現(xiàn)8種，研究比較清楚的是受體I、受體Ⅱ和受體Ⅲ。這3種受體具有較高的同源性，其中受體I和受體Ⅱ參與TGFβ的信號(hào)傳導(dǎo)，而受體Ⅲ與信號(hào)傳導(dǎo)無關(guān)[9]。TGFβ與細(xì)胞膜表面的Ⅱ型受體形成復(fù)合物，經(jīng)活化才能產(chǎn)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。在此過程中Ⅱ型受體胞質(zhì)區(qū)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域可將Ⅰ型受體胞漿區(qū)GS結(jié)構(gòu)域的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，繼而Ⅰ型受體磷酸化。活化后的Ⅰ型受體進(jìn)一步作用于細(xì)胞內(nèi)的下游分子，使TGFβ的信號(hào)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ⅱ型TGFβ受體的基因中含有一段10bp的多聚A重復(fù)序列，該序列增加或丟失堿基都將導(dǎo)致Ⅱ型TGFβ受體變構(gòu)而失活,從而使TGFβ不能與受體正確的結(jié)合并發(fā)揮生物學(xué)作用。由此可見，TGFβⅡR在TGFβ的信號(hào)傳導(dǎo)過程中起著不可替代的關(guān)鍵作用。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇TGFβⅡR作為基因沉默的靶點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確地阻斷TGFβ的信號(hào)傳導(dǎo)。
本實(shí)驗(yàn)首先構(gòu)建兩個(gè)靶向TGFβⅡR的siRNA真核表達(dá)載體，并將其中之一的siRNA1成功轉(zhuǎn)染了正常人外周血T細(xì)胞，使T細(xì)胞表面的TGFβⅡR基因沉默，TGFβ的信號(hào)傳導(dǎo)過程被阻斷，從而使T細(xì)胞活性增高。siRNA2載體未能成功轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的原因，考慮與轉(zhuǎn)染條件(脂質(zhì)體的用量、DNA密度、細(xì)胞密度、脂質(zhì)體和DNA混合孵育時(shí)間)未達(dá)到最佳優(yōu)化有關(guān)。
