中國幽門螺桿菌研究:雙特異抗體酶免疫染色法檢測幽門螺桿菌抗體

自從1983年Warren和Marshall從人胃粘膜成功地分離出幽門螺桿菌（Hp)后，已有越來越多的實驗結果表明Hp與慢性胃和潰瘍病有密切關系，可能是這些疾病的致病因素之一。目前診斷Hp的方法主要有組織培養(yǎng)法、尿素酶試驗和各種染色法。鑒于這些方法繁瑣、費時、須胃鏡取材才能完成等，尋找一種敏感性高、特異性好、快速且簡便的診斷Hp的方法，是目前急需研究和解決的問題。本文報道建立一種新的免疫酶技術—“雙特異抗體”酶免疫染色法，現(xiàn)將結果報告如下。

1　材料和方法

1.1　材料

①試劑：辣根過氧化物酶（HRP)，R2≈3.0，系中科院上海生化研究所產品。底物：3.3"二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸（DAB－4HCI)，瑞士產品。②“雙特異抗體”的制備：人血清IgG的提純按飽和硫酸銨四步鹽析法進行。雙抗原的制備按改良過碘酸鹽法，用HRP標記純化的人IgG，制成免疫用的雙抗原。動物免疫。動物：體重分別為2.5kg和3.0kg的雄性家兔2只。免疫：初次免疫是將含HRP20mg，IgG5mg的雙抗原加等體積的福氏不完全佐劑多點、多部位注射于每只家兔的四肢。間隔1月后用原劑量的雙抗原加福氏不完全佐劑以同樣方式進行第二次免疫。3周后用加倍的雙抗原經耳靜脈注射。7d后試血，當兔抗人IgG抗體和抗HRP抗體效價達1：32以上時頸動脈放血，分離血清－20℃保存。將雙抗血清與人IgG和HRP同時做雙擴散試驗。瓊脂免疫雙擴散第1孔為雙抗血清，第2孔為人IgG、第3孔為HRP，形成2條相互交叉的沉淀線。顯示雙抗血清與人IgG和HRP形成兩條相互交叉的沉淀線。③Hp菌液的制備：將NCTC11638Hp標準菌株（由澳大利亞皇家佩思醫(yī)院惠贈)和本院胃鏡檢查鉗取患者胃粘膜分離培養(yǎng)獲得的25株Hp菌株分別接種于心腦血平板培養(yǎng)基上，37℃微需氧環(huán)境培養(yǎng)3d～5d后進行生化學和形態(tài)學鑒定，傳代培養(yǎng)后刮下菌苔制成菌液，以2‰甲醛固定，離心沉淀洗滌3次后測濃度。預實驗使用標準菌液，正式實驗采用混合菌液。④被檢血清：隨機抽取我院1988年胃鏡檢查患者的靜脈血，分離血清低溫保存。同時鉗取胃粘膜做尿素酶試驗（HpUT)、組織培養(yǎng)和病理查。

1.2　方法

將待測血清用生理鹽水稀釋成1：200滴于已固定Hp菌的玻片上，37℃溫育30min，漂洗、風干。再加“雙特異抗體”和HRP各一環(huán)，同上溫育、洗滌后，加新配制的DAB一環(huán)，溫育10min后漂洗、風干、油鏡下觀察結果。同時設陰性血清、PBS和正常兔血清對照。結果判斷：根據(jù)菌體著色程度和是否膨大記www.med126.com以＋～+++。“＋”—菌體染色呈灰黃色，“++”—菌體呈黃色并膨大，“+++”—菌體膨大并呈黃褐色，“++++”菌體呈深褐色而膨大。當蓖體染色為“++”以上時為陽性。

2　結果

2.1　雙特異抗體酶免疫染色法（bispecificantibody　enzymatic immunostaining，BSABEIS)的建立

按方陣滴定法進行。將1.8×10⁹/ml的Hp菌液一環(huán)固定玻片，再加1：2比稀釋至1：128的陽性血清，溫育洗滌后加1：2至1：64倍經稀釋的“雙特異抗體”和HRP（0.01mg/ml)，同上溫育洗滌后加底物液，10min后觀察結果（表1)。表1所示，當陽性血清在1：64稀釋的血清和1：16“雙特異抗體”作為工作濃度。固定抗原（1.8×10⁹/ml)和陽性血清（1：64)的濃度，將雙抗按1：2至1：64倍比稀釋，HRP從0.32mg/ml倍比稀釋至0.005mg/ml，按以上步驟和條件進行染色，結果見表2。表2顯示，HRP在0.005mg/ml，雙抗在1：16以上時，均呈“+++”的陽性結果，為保證實驗的準確性，正式實驗選用0.01mg/mlHRP和1：16雙抗作為工作濃度。

表1　陽性血清和雙特異抗體最適濃度選擇

表2　雙特異抗體和HRP最適濃度選擇

特異性試驗　分別用20億/ml的Hp、霍亂弧菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌、白色念珠菌、福氏痢疾桿菌、宋氏痢疾桿菌、副傷寒桿菌甲、副傷寒桿菌乙、不凝集弧菌和空腸彎曲菌制成涂片標本，依次加Hp陽性血清、雙抗體、HRP和底物染色后鏡檢、同時設陰性血清、PBS和正常兔血清對照。結果顯示，除Hp呈+++的陽性染色外，其余細菌染色均呈陰性、對照組也均未著色。

敏感性試驗　選擇6份Hp陽性血清，按上述方法染色，同時與試管凝集試驗和顯微凝集試驗進行對比。結果顯示，本法測得抗體效價＞1280，顯著高于試愛凝集（1：320)。

2.2　BSABEIS法的臨床應用

用本法檢測100例慢性胃炎和潰瘍病患者血清，同時與培養(yǎng)法Hp和尿素酶試驗HpUT進行對比（表3)。結果顯示，本法陽性率（71％)高于HpC法（59％)和HpUT法（62％)，但無顯著性差異（P＞0.05)。三種檢測方法檢測結果符合率比較結果見表4～5。BSABEIS法與HpC法和HpUT法的總符合率分別是62％和61％。

表3　BSABEIS法與其它二種方法對比　�。╪：100)

表4　BSABEIS法與HpC法比較　　（n：100)

表5　BSABEIS 法與HpC法比較（n：100)

3　討論

自NakaneAvrameas（1966)建立酶標抗體技術用于定位抗原以來，已發(fā)展了許多免疫酶技術，可歸納為二大類，即標記抗體和非標記抗體免疫技術，后者避免了標記過程中酶和抗體活性減弱及標記與未標記抗體間競爭干擾，從而提高敏感性和特異性。Steruberger等采用抗酶抗體法（PAP)檢測鉤端螺旋體，發(fā)現(xiàn)其錄敏度較熒光抗體法比高100～1000倍。Petrali等也發(fā)現(xiàn)了PAP法比抗體搭橋法靈敏5～20倍。Moriaty等實驗證實了PAP法優(yōu)于放射免疫法。最近Milstein制備一種既抗抗原雙抗酶的雙抗體，提高了檢測敏感性和特異性。本文建立的“雙特異抗體”酶免疫染色法就基于以上原則而制成既抗人IgG又抗HRP的“雙特異抗體”。經臨床標床檢測結果證實其所能測出的抗體滴度顯著高于顯微凝集法和試管凝集法（4～8倍)，并與10種腸道菌均無交叉反應。檢測Hp感染率高于培養(yǎng)法和尿素酶試驗，總符合率分別是62％和61％，但BSABEIS法71例陽性中HpC法和25例示檢出，HpUT法62例陽性中本法有15例未檢出，可能病人尚處于感染初期，抗體水達到檢出的水平。關于“雙特異抗體”的本質有待進一步闡明。