衛(wèi)生毒理學(xué)-實(shí)驗(yàn)指導(dǎo):實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生物標(biāo)本收集及處死

 1．血液采集  終末和非終末采血技術(shù)(如麻醉，取血體積)是有區(qū)別的，在以動(dòng)物死亡為實(shí)驗(yàn)結(jié)束(終末實(shí)驗(yàn))時(shí)的情況下采血與在清醒動(dòng)物身上單次或多次采血的情況是迥然不同的。

在實(shí)驗(yàn)過程中減少動(dòng)物的疼痛與不安和獲得預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一樣重要。這不僅是出于人道主義，而且也是良好科學(xué)實(shí)踐所要求的內(nèi)容。因某一特定采血技術(shù)的動(dòng)用和由此給動(dòng)物帶來的不安可能會(huì)使動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激，而伴隨應(yīng)激反應(yīng)出現(xiàn)的許多生化和生理改變會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如血中兒茶酚payment-defi.com/yaoshi/胺類、催乳素和糖皮質(zhì)激素的升高會(huì)影響葡萄糖、紅細(xì)胞數(shù)、白細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞壓積等一些代謝參數(shù)。所以如果不能完全排除應(yīng)激，那么也應(yīng)將應(yīng)激降至最小程度．這不只是為動(dòng)物考慮，也是為獲得有代表性數(shù)據(jù)的良好科學(xué)實(shí)驗(yàn)所需。

在非終末采血中；不要抽血太多，因?yàn)槿⊙�過多會(huì)減少總血量而導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)果．總血量的減少會(huì)伴隨血紅蛋白含量、氧轉(zhuǎn)運(yùn)能力和血壓的下降及應(yīng)激相關(guān)激素濃度的升高，也可能進(jìn)一步產(chǎn)生其他變化，如胃粘膜壞死等。

血液總量取決于物種、性別、年齡、健康及營養(yǎng)狀況。對于同一種物種，較大動(dòng)物單位體重的總血量比較小的動(dòng)物要少，老齡和肥胖動(dòng)物比年輕和正常體重的動(dòng)物單位體重含總血量少。一般情況下，總循環(huán)血量為55~77mI／kg體重。

非終末采血可分為單次和多次采血，單次采血量低于動(dòng)物總血量的15%，對動(dòng)物不會(huì)有影響。然而，若取量為總血量的15%～20％，則會(huì)出現(xiàn)一些副作用，如心排血量或血壓降低。如果取總血量的30％一40%則會(huì)引起缺血性休克，若取血達(dá)40％可引起約50％的豬和大鼠死亡。

康的沒有明顯不良反應(yīng)的動(dòng)物，單次采血不超過動(dòng)物總血量的15%，可在3—4周居重復(fù)采血。多次采血每24h不應(yīng)超過總血量的1%[o．6 mi／(kg，d)]，若采集次數(shù)和(或)采血量過多則引起貧血。

對大、小鼠采取不超過o.1ml的毛細(xì)管中血液常用尾尖果血法．眼眶靜脈叢穿刺通常適用于無尾動(dòng)物如倉鼠。當(dāng)尾靜脈不能滿足較大的采血量時(shí)，大/小鼠也可用此技術(shù)．一般要求在麻醉下操作。只有當(dāng)沒有別的方法的特殊情況下，2周后才能考慮用動(dòng)物恢復(fù)的眼眶靜脈叢再次取血。這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)由訓(xùn)練良好的工作人員來操作，而且只能用動(dòng)物的一只眼睛．不贊成在無麻醉?xiàng)l件下，用眼球摘除法取血。

在毒物動(dòng)力學(xué)研究中，大鼠采血可采用；尾靜脈、趾脈管系、全麻下心臟穿刺、全麻下外頸靜脈和總頸動(dòng)脈插管。

兔和豚鼠可用耳繞靜脈、頸靜脈或隱靜脈。較大動(dòng)物的采血可從淺表靜脈進(jìn)行(隱靜脈、頭靜脈、頸靜脈)。

2．尿液采集  大鼠和小鼠可用代謝籠，下部有糞尿分離鋁。在毒物動(dòng)力學(xué)研究中，對半減期長(數(shù)小時(shí)以上)的受試化學(xué)物可用代謝籠，對半減期短的受試化學(xué)物可在全麻下經(jīng)尿道或經(jīng)腹壁插管至膀胱收集尿液。對犬可用接尿法或?qū)�尿法�?/P>

  3．膽汁采集  在毒物動(dòng)力學(xué)研究中，可直接插管至總膽管，其尖端應(yīng)接近肝門區(qū)的分叉點(diǎn)．大鼠膽汁一般達(dá)0.5－1.0ml。插管后應(yīng)立即給以受試化學(xué)物，因?yàn)槟扄}不能再循環(huán)時(shí)，膽汁的成分就會(huì)改變。對有膽囊的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如豚鼠和兔)，應(yīng)在膽囊基底部結(jié)扎膽囊，以防止膽囊延緩經(jīng)膽汁消除。

4．糞便采集  大鼠和小鼠可用代謝籠，下部有糞尿分離器糞，分析前剃去表層，取內(nèi)層糞分析．

 在麻醉過程中，必須對動(dòng)物仔細(xì)觀測。所用技術(shù)設(shè)備應(yīng)可對多個(gè)系統(tǒng)進(jìn)行檢查，如循環(huán)系統(tǒng)(心率、脈搏、血壓”心電圖、外周灌流量、體溫)或呼吸系統(tǒng)(呼吸頻率)。在麻醉程中確定麻醉深度是一個(gè)非常重要的步驟。麻醉分為四個(gè)時(shí)期。

(1)痛覺喪失期(從藥效開始發(fā)揮到意識(shí)喪失)。

(2)興奮期t從意識(shí)喪失開始出現(xiàn)到規(guī)則呼吸結(jié)束。呼吸不規(guī)則，瞳孔擴(kuò)大，運(yùn)動(dòng)反射增強(qiáng)，眼球震顫，角弓反張．

(3)耐受期，從規(guī)則呼吸開始到自主呼吸結(jié)束。這個(gè)時(shí)期又分為四段；①規(guī)則呼吸，瞳孔縮小，多數(shù)反射出現(xiàn)；②骨骼肌松弛，瞳孔縮小，眼瞼反射消失，角膜反射出現(xiàn)，呼吸平穩(wěn)，痛覺缺失，是進(jìn)行手術(shù)的最佳麻醉狀態(tài)，③只有角膜反射，呼吸非常困難，瞳孔擴(kuò)大，④沒有反射，砰吸非常平穩(wěn)，瞳孔擴(kuò)大。

 (4)窒息期：反射性脯呼吸結(jié)束之后毒劑防止死亡。

應(yīng)用乙醚時(shí)上述各期出瑰較為明顯應(yīng)用時(shí))，動(dòng)物的反應(yīng)會(huì)和上述有所不同沒有反射，沒有呼吸，瀕臨死亡，需立即使用解毒劑

進(jìn)行手術(shù)的最佳麻醉狀態(tài)是意識(shí)喪失，痛覺喪失和松弛．對不同物種、根據(jù)麻醉的持續(xù)時(shí)間，常將短效(30min)、中效(120m[n]、長效(長于120min~,麻醉劑聯(lián)合用藥。

在麻醉時(shí)和麻醉后必須檢查動(dòng)物的體溫，當(dāng)體溫降低時(shí)，要使用加熱燈、加熱墊．在醉終止后動(dòng)物要經(jīng)歷和麻醉過程相同但順序相反的幾期(耐受期、興奮期、痛覺喪失

常用的麻醉藥物：

(1)短效：對嚙齒類多用乙醚，對大動(dòng)物可用硫噴妥鈉10～25mg／kg靜脈或腹腔注

 (2)中效，推薦用賽拉嗪+氯胺酮，對嚙齒類5＋100mg／kg肌內(nèi)注射，對大動(dòng)物2+tag／kg肌內(nèi)注射。

  (3)長效；常用戊巴比妥鈉，對嚙齒類35～50mg／kg腹腔注射，對大動(dòng)物30mg／kg靜脈或腹腔注射，對大鼠還可用烏拉坦1500rug／k8肌內(nèi)注射．

安死術(shù)(euthanama)是指用公眾認(rèn)可的、以人道主義的方法處死動(dòng)物的過程，即達(dá)到有驚恐或焦慮而安靜地、無痛苦地死亡．安死方法的最重要性的標(biāo)準(zhǔn)是：安死術(shù)應(yīng)具有證動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)立即達(dá)到失去痛覺的早期抑制作用．選擇哪種安死術(shù)必須根據(jù)待死動(dòng)物的感覺能力而不是根據(jù)實(shí)驗(yàn)觀察者或操作者的主觀payment-defi.com/shouyi/感覺，盡管后者是不容忽視．因此斷頭術(shù)或放血致昏法還不失為人道主義的安死術(shù)。安樂死的方法對動(dòng)物的物種年齡應(yīng)是適宜的，而且應(yīng)是無痛苦，不引起興奮，能快速導(dǎo)致意識(shí)喪失和死亡．此外，方應(yīng)是可靠、可重復(fù)和不可逆的。

建議在實(shí)施任何安死術(shù)前；對犬、貓及大型動(dòng)物，都應(yīng)使用鎮(zhèn)靜劑。如果可能，即將處死的動(dòng)物不應(yīng)和其他動(dòng)物在同一個(gè)房間里，特別是當(dāng)用比較殘忍的方法時(shí)，如斷頭法。

安樂死之后，確認(rèn)動(dòng)物死亡非常關(guān)鍵。死亡癥狀有心跳、呼吸停止，反射缺失�？赏ㄟ^放血或取出心臟，毀損大腦，斷頭，切除內(nèi)臟，出現(xiàn)尸僵等來確保動(dòng)物死亡。 

毒性病理學(xué)檢查是毒理學(xué)試驗(yàn)重要的組成部分，病理學(xué)研究有助于確定有害作用和器官。毒性病理學(xué)檢查包括大體解剖和組織病理學(xué)檢壹兩部分。急性毒性試驗(yàn)中在試期中死亡或試驗(yàn)結(jié)束處死的動(dòng)物都應(yīng)進(jìn)行尸體解剖，因?yàn)榧毙远拘栽囼?yàn)的目的是得到有關(guān)可能的靶器官以及進(jìn)行重復(fù)染毒試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)的信息。在亞慢性、慢性、致癌試驗(yàn)病理學(xué)是一個(gè)重要的終點(diǎn)。

1．大體解剖  在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后半小時(shí)內(nèi)進(jìn)行，解剖方法采廚胸腔，腹腔臟聯(lián)合取出法。應(yīng)觀察有關(guān)臟器的外形和表面情況、顏色、邊界和大小、質(zhì)地、切面．對指定自器稱重，并計(jì)算臟器系數(shù)。

   2．組織病理學(xué)檢查  對指定的器官或組織用鋒利的刀剪取材，應(yīng)統(tǒng)一取材部位。組織塊一般在10倍體積的10％福爾馬林液中固定，此后常規(guī)制片(組織石蠟包埋、切HE染色)。應(yīng)詳細(xì)記錄顯微鏡下觀察到的病變，并做出病理診斷。必要時(shí)，請其他病理學(xué)家對有疑問的或有爭論的發(fā)現(xiàn)進(jìn)行復(fù)查．利用特殊染色、組織化學(xué)及電子顯微鏡技術(shù)可有助于毒作用機(jī)制的研究。