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您現(xiàn)在的位置: 醫(yī)學(xué)全在線 > 理論教學(xué) > 基礎(chǔ)學(xué)科 > 免疫細(xì)胞與核酸分子雜交 > 正文:免疫細(xì)胞化學(xué)與圖像分析
    

免疫細(xì)胞化學(xué)與圖像分析

  在細(xì)胞生物學(xué)中,一個常見的問題是如何獲取與細(xì)胞功能相關(guān)的各種定量測量信息。在免疫細(xì)胞化學(xué)中也存在同樣的問題。制作免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本環(huán)節(jié) 較多,只要有一個環(huán)節(jié) 失誤就會影響實驗結(jié)果,除了需要精制的藥品外,還需要熟練的技術(shù)。那么,做成了理想的標(biāo)本后,如何進(jìn)行觀察,才能獲得盡量多的的各種定量信息,而且使這些信息能較客觀的反映出來,這就是本章 的編寫目的。

  一、定量分析的重要性

  目前有許多研究免疫細(xì)胞化學(xué)的文章 ,是做定性和定位研究的。如有文獻(xiàn)中提到,P物質(zhì)在腦組織中存在于30處以上,這只是解決了定性定位問題,這些部位含P物質(zhì)的量是否相同?可否用快速簡便的方法對細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)產(chǎn)物的量進(jìn)行分析?從而可進(jìn)行比較。所謂反應(yīng)產(chǎn)物的“量”包括顏色深淺,其所占的長度或面積等,就要借助于圖像分析儀(image analyzer)了。

  以往我們對免疫細(xì)胞化學(xué)或一般組織化學(xué)光鏡標(biāo)本的觀察,對反應(yīng)產(chǎn)物的量常用“+”號表示,一般可分為0~+++,共五個等級,這種方法對差別較大的標(biāo)本當(dāng)然還是可以用的,但存在以下三方面的問題:①同一張標(biāo)本,不同的觀察者可以得到出不同的結(jié)論,因為這種分級沒有明確的客觀標(biāo)準(zhǔn);②即使同一張標(biāo)本同一個觀察者,間隔若干天后進(jìn)行再次觀察時,可能結(jié)論也不一樣的;③最后一點也是最重要的一點,人的視覺是有一定限制的,用一般觀察法實際上已經(jīng)丟失掉了許多可貴的信息,因為你察覺不到實際上存在的較小的差異。因此我們力求有一個客觀的比較精密的標(biāo)準(zhǔn)。除了常用的儀器如顯微分光光度計(microspectrophotometer)和顯微密度計(microdensitometer)等以外,還可用圖像分析儀進(jìn)行測量。前二者已有許多有關(guān)著作中介紹過,就其精確與靈敏來說都是夠的,但卻不能同時測出標(biāo)本中某些成分的面積、體積或長度等其他極有用的參數(shù)。圖像分析儀的分析廣度則要大得多,并能明顯地提高工作效率,所得到的各種數(shù)據(jù)可通過分析儀上的計算機(jī)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,只要將各種統(tǒng)計學(xué)公式輸入計算機(jī),選擇其中你所采用的公式,即可快速得出分析結(jié)果,告訴你有無顯著性差異。

  二、圖像分析儀簡介

  圖像分析儀又稱圖像分析系統(tǒng)(image analysis system),主要用來解決如何客觀地較精確地用數(shù)字來表達(dá)存在于標(biāo)本中的各種信息,可稱為數(shù)學(xué)形態(tài)學(xué)。它已經(jīng)成為一種公認(rèn)的科學(xué)研究工具,并且逐漸展現(xiàn)出巨大的潛能。圖像中包含著極其豐富的內(nèi)容,是人們從客觀世界中獲得信息的重要手段,因此,正確地測量和處理圖像已成為測量技術(shù)中的重要課題,并廣泛應(yīng)用于航空遙感測量、金屬圖像測量、微電子技術(shù)中微圖形檢測、精密機(jī)件尺寸檢測,光波干涉圖、醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究及應(yīng)用等有關(guān)領(lǐng)域中。圖像測量將會隨著信息科學(xué)和人工智能的發(fā)展而日益顯示其重要作用,F(xiàn)代圖像測量是光學(xué)、電子學(xué)、計算機(jī)技術(shù)等相互滲透的跨學(xué)科的結(jié)果,涉及廣泛的學(xué)科領(lǐng)域,醫(yī)學(xué)只是其中一個分支。

  我們在光學(xué)顯微鏡下看到的是光學(xué)圖像,而在圖像分析儀屏幕上看到的是電子圖像,因此在顯微圖像分析中,整個系統(tǒng)最重要最關(guān)鍵的工作就是要保證得到的電子圖像能最精確地反映出光學(xué)圖像,這個過程由攝像機(jī)(圖像掃描器)、顯像管和圖像處理機(jī)(計算機(jī))來完成(圖9-1)。圖像可通過光學(xué)顯微鏡、透射電鏡或掃描電鏡傳到攝像機(jī)而產(chǎn)生電信號,照片或膠卷上的圖像也可以通過攝像機(jī)反映到電視屏幕上進(jìn)行分析。圖像在電視屏幕上是由許多像素(pixel)構(gòu)成的,單位面積屏幕上像素愈多則圖像愈清晰,即分辨率愈高。各廠家生產(chǎn)各種不同規(guī)格的產(chǎn)品,如有640×480像素的、896×704像素的、512×480像素的屏幕等。當(dāng)圖像顯示時,每個像素含有兩方面的信息,即此像素的灰度及其在標(biāo)本中的位置,兩種信息決定了圖像的形狀和顏色深淺。

圖9-1 圖像分析系統(tǒng)簡圖

  有關(guān)圖像分析的學(xué)術(shù)活動,1963年召開了第一屆國際討論會,此后每四年有一次國際學(xué)術(shù)交流活動。1983年在美國召開了第六屆國際學(xué)術(shù)會議,與會代表約150人。1987年9月在法國召開了第七屆學(xué)術(shù)會議,在200多正式代表中有2/3是生物醫(yī)學(xué)方面的專家,而我國生物醫(yī)學(xué)界沒有人被邀參加,可見我國過去對如何將圖像分析應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)方面的研究重視得不夠,對國際上這方面的信息掌握得不及時。國內(nèi)自70年代末期相繼從國外引進(jìn)大型自動圖像分析儀后,80年代才開始將醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究與圖像分析方法結(jié)合起來。從1981~1983年召開了三次全國體視學(xué)與圖像圖像分析學(xué)術(shù)會議,1987年召開了第四次學(xué)術(shù)會議,雖然在宣讀的論文中醫(yī)學(xué)研究已占了很大的比例,但具體應(yīng)用到免疫細(xì)胞化學(xué)則實例極少,僅是一個開端。1988年中國體視學(xué)會正式成立,是在民政部登記的屬于新學(xué)科的第一個學(xué)會。并于1991年11月在重慶第三軍大學(xué)召開了“全國計量學(xué)在形態(tài)學(xué)研究中應(yīng)用研討會”,與會代表來自22個省市,形態(tài)計量學(xué)的方法已應(yīng)用到組織學(xué)、解剖學(xué)、病理學(xué)、細(xì)胞學(xué)等領(lǐng)域。更為可喜的是過去此類研討會都是請外商到會介紹他們的產(chǎn)品,為他們提供中國市場,而此次會議上本國的三家研制生產(chǎn)圖像分析儀的單位在大會上介紹各自的產(chǎn)品,以較好的性能價格比與國外產(chǎn)品競爭,擴(kuò)大國內(nèi)市場,我國在此領(lǐng)域的研究進(jìn)展也是很快的。醫(yī).學(xué) 全在.線,提供www.med126.com

  三、常用的測量方法

 。ㄒ)灰度

  灰度(grey level)指圖像各種分顏色的深淺程度。比較高級的圖像分析儀可將灰度分成為256級,也有的只能將灰度分成64級,總之都是2n,24是26256是28。免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本上反應(yīng)產(chǎn)物的染色深淺即可用灰度來表示。能將一張標(biāo)本上不同染色深度區(qū)分為幾十或更多的等級,這是人眼所不及的。因此,某些實驗的結(jié)果,如果用光學(xué)顯微鏡作一般的觀察,似乎實驗組與對照組無明顯差異,而用圖像灰度法經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析,則可反映出顯著性差異,說明僅僅用顯微鏡觀察是不夠的,在某些情況下可能會辜負(fù)了制片過程中所花費的大量精力,而得不到應(yīng)有的結(jié)果。

  由于免疫反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)不一定是均勻分布的,在同一個細(xì)胞中就可產(chǎn)生各種灰度,這種情況如何進(jìn)行比較?有兩類方法可供選用:一種是測每個細(xì)胞的平均灰度,近年較新型的圖像分析系統(tǒng)有此性能,而比較早期的或比較簡單的圖像分析系統(tǒng)就沒有這種性能,例如某一細(xì)胞在電視屏幕上占有120個像素,按灰度級進(jìn)行測量后,也許120個像素中有十多種不同的灰度,分析儀可立即顯示其平均灰度。另一種方法是在反應(yīng)產(chǎn)物不均勻的細(xì)胞中可用每一種灰度所占的百分率來表示,例如你要觀察1000個細(xì)胞,在這些細(xì)胞中各種灰度所占的百分率可測出,并作出曲線,或用其他統(tǒng)計學(xué)方法處理,來進(jìn)行比較。

  如果用彩色圖像分析儀,除了上述的灰度測量以外,還可以將不同的灰度編成不同的顏色,使圖像更鮮明美麗,而且便于測量。彩色有兩種情況:在屏幕上出現(xiàn)與標(biāo)本一樣的顏色稱為真色(real color),如果將不同的灰度轉(zhuǎn)換成不同的顏色則稱為假色(pseudo color),應(yīng)用假色的目的是增強(qiáng)對比度,來改善對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的視覺識別,同時可增強(qiáng)輪廓用來強(qiáng)調(diào)結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié) 。例如,免疫細(xì)胞化學(xué)中常用的非標(biāo)記抗體過氧化物酶—抗過氧化物酶法,最終反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色,假設(shè)在腦內(nèi)某核團(tuán)的許多細(xì)胞中,呈現(xiàn)出不同深度的棕色,深淺差別較大者顯示在屏幕上人眼還能區(qū)別,若差別小的則不易區(qū)別了,操作者可將灰度11~15用紅色顯示,灰度16~20用藍(lán)色顯示、灰度21~25用黃色顯示、灰度26~30用綠色顯示等。一般可呈現(xiàn)數(shù)十種顏色。也可以將灰度11~20用深紅色顯示、灰度21~30用淡紅色顯示、灰度31~40用藍(lán)色顯示等,由操作者隨心所欲加以編輯。這種圖像如拍攝下來,旁邊顯示出一條彩色帶,表明什么顏色代表什么范圍的灰度,如此可將一種顏色的免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)本轉(zhuǎn)換成多種彩色的,對比鮮明的照片。

  有些圖像分析儀中帶有光密度計組件,光密度計能將掃描器視頻信號變換成對數(shù)等值,然后數(shù)值化,就能用絕對光密度單位來校正。因此,光密度計把被測物的積分光密度作為主要輸出,所謂積分光密度即各個單獨探測的像素密度分布的總和。因為容易得到被測物的面積,也就很容易求出平均密度。光密度在細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)的定量領(lǐng)域內(nèi)極為有用;叶仁且环N相對值,因為你可將標(biāo)本上的灰度隨你編輯分為64級、也可將其分為128級或者256組,而光密度是絕對值。在文獻(xiàn)中光密度常用OD表示(optical density)。有的單位購置了圖像分析儀后才發(fā)現(xiàn)不能作光密度測量,但已無法再去掉換,所以在購買前必須詳細(xì)了解其性能,包括屏幕像素數(shù)、有無光密度計組件等。

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